Summary
Техника представлена в естественных условиях коллекция образцов интерстициальной жидкости из тканей соответствующих сайтах (здесь, экспериментально воспаленной кожи) для измерения биохимических посредническую боль и воспаление.
Abstract
Это, в естественных условиях человеческого биопробы могут быть использованы для изучения человеческих добровольцев и пациентов. Образцы собраны из соответствующих сайтов, таких как ткани кожи через асептически вставлены микродиализа катетеров (Кожные диализа, Эрланген, Германия). Иллюстрированная в этом примере коллекции тканевой жидкости из воспаленной кожи экспериментально в человеческих добровольцах. Пробы могут быть объединены с другими экспериментальными испытаниями. Например, одновременная оценка локально выпущен биохимических и субъективных чувствительность на болевое раздражение в экспериментально воспаленной кожи обеспечивает критические биохимические-поведенческая ссылку для определения биомаркеров боль и воспаление. Представленный анализ в жизни человеческого организма позволяет механистического понимания тканеспецифические процессы, лежащие боль и / или воспаления. Метод также хорошо подходит для изучения эффективности существующих или новых мероприятий - таких, как новые кандидаты препарата - ориентированные на лечение болезненных и / или воспалительных состояний. Эта статья даст подробное описание на использование микродиализа методики сбора тканевой жидкости из воспаленной кожи экспериментально поражением человека в качестве субъекта исследования. Интерстициальный образцы жидкости, как правило, обрабатываются с помощью мультиплекс бусинка иммунологических массив позволяет опробования до 100 аналитов в образцах, как небольшие по объему до 50 мкл.
Protocol
Индукция экспериментальных воспаления:
- Первой степени загара индуцируется в не-загорелая кожа бедра с помощью калиброванного, ультрафиолетового источника B (Saalmann Multitester SBB LT 499, Saalmann GmbH, Херефорд, Германия). Загара индуцирована за 24 часа до начала микродиализа эксперимент, применяя в три раза количество UVB света необходимые для обеспечения полного покраснения открытые участки кожи, или три раза минимальный эритемная дозы (МЭД). MED определяется в каждом субъекте до начала исследования посвящения. Точная доставка энергии обеспечивается с УФ-метровый (RM 12, доктор Grobel УФ-Electronic GmbH, Эттлинген, Германия).
Катетера и отбора образцов:
- Подготовка плацдарма с стерильные перчатки, стерильные 1 держатель иглы, Луер 1cc наконечник шприца с 23 калибра (G) иглой, 1cc шприц с иглой 30G, 1% лидокаин, спиртовые тампоны, 2x2 стерильные марлевые прокладки, микродиализа катетеры прилагаются в одном конец 4 см 23G иглы (кожная диализа, Эрланген, Германия), и 1,5 мл Microcent трубы коллекции (E & K Научные, Санта-Клара, штат Калифорния.) с 4μl решение ингибитор протеазы в 100 мкл образца в сухом льду. Решение ингибитор протеазы производится согласно инструкции производителя, используя ингибитор протеазы коктейль таблетки (Roche Diagnostics, GmbH, Мангейм, Германия).
- Подготовка 1% раствор альбумина человека в раствор лактата Рингера и втянуть его в 1cc наконечника шприца Luer, убедившись, что Есть нет воздушных пузырей, оставшихся в шприц.
- Нагрузка шприц с 1% человеческого альбумина обогащенного раствора лактата Рингера в колыбель (микродиализа нескольких шприц стойку, Гарвардский аппарата, Южная Натик, штат Массачусетс), установленный на насос высокого инфузии точности (насос 22, Гарвардский аппарата, Южная Натик, штат Массачусетс ). Убедитесь, что бар инфузионный насос вождения шприце находится в полном контакте с поршень шприца. Установить насос скорость после подтверждения, что шприц диаметр был точно вступил в насос. Часто используемые скорости инфузии в диапазоне от 2 до 4μl/min.
- Определите область, которую планируют собрать ваши выборки из. При отборе проб из искусственно созданных воспаленной области, такие как солнечные ожоги, описанных выше, план по установке катетера на краю солнечного ожога.
- Чистая небольшую площадь на противоположных краях поражения, или сайта вы намерены собирать ваш образец из, с алкоголем. Эти очищенных областей будут предназначены вставки и точки выхода для катетера. Inject достаточно лидокаина внутри подкожно (о чем свидетельствует побледнение кожи на инъекцию) на этих сайтах, чтобы создать очень маленький волдырь (не более 2 мм). Введение такой ограниченный объем внутри-кожных лидокаина в точки входа и выхода из микродиализа катетер не должен изменять результаты биопроб но делает вставки катетер значительно менее болезненным для изучения предметов.
- Использование асептики, вставьте микродиализа катетеры с помощью иглы 23G прилагается по длине изучить участок кожи. Глубина вставки на границе кутис и подкожного слоя. Вставка в достаточная глубина может быть проверена оптически. Как игла и прилагается катетер перемещаются вперед игла должна вызывать немного вверх-складывания кожи, а также некоторые побледнение кожи. Нет кровотечение должно произойти. Если кровотечение все же происходит это означает, что игла находится глубже, чем предполагалось, и глубина вставки должен быть скорректирован. Как только игла была протолкнул точки выхода из кожи, промойте катетер с 1% альбумина обогащенного раствора лактата Рингера, пока не увидите капель по длине катетера. Это делается путем вставки аккуратно иглой конца шприц (игла 23G) в дистальном конце катетера микродиализа, и медленно инъекционного раствора.
- После промывки катетера осторожно потяните на иглу кормить прилагается катетер через кожу. Нежные обработки не требуется, поскольку катетеры малого диаметра, а следовательно, хрупкая. Вытяните катетер, пока он полностью пронизывается через кожу, то есть база большие пластиковые трубы вложение дистального конца катетера соприкасается с кожей в точке входа. Как упоминалось выше, практически нет кровотечения в конце процедуры подтверждает оптимальное размещение катетера.
- Прикрепить дистального конца катетера, чтобы кончик иглы 23G шприц отдыхая в стойку инфузионного насоса. Уход необходим, чтобы избежать проколов иглой через стенку катетера, что приведет к потенциальной утечки.
- Вырезать иглы от проксимальный конец катетера.
- Использование ¼-дюймовый розовые ленты, придают подготовленные 1,5 мл Microcent трубки коллекции кожи близко к выходу сайта катетер. Место кончике катетера в пробирку, чтобы коллекция microdialysate. Начало перфузии насоса при заданном тели и периодически проверять, что поставлено и сборник соответствуют друг другу. В случае, если объемы не совпадают, утечки с сайта вступления кожи, должны быть исключены (иногда может быть решена путем вытягивания части катетера, который встраивается с помощью пластиковой трубки более плотно на сайте вступления кожи). Кроме того, катетер, возможно, должны быть заменены, если доставлены и собраны объемы не соответствуют друг другу.
- После завершения отбора проб, образцы находятся на сухой лед, пока хранения при температуре -80 º C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Комбинированное использование микродиализа техники и технологии мультиплексирования иммуноанализа является ценным в режиме реального времени, в естественных условиях человеческого биопроб, содержащие информацию биохимических реакций в тканях, представляющих интерес. В сочетании с поведенческие тесты, такие как боль тесты, метод позволяет изучать сложные взаимодействия биохимических посредническую боль и воспаление. Метод перспективен для 1) определение ткани специфических биомаркеров посредническую боль и воспаление, 2) обеспечение механистического понимания патологии воспалительные и хронические боли условиях с патологией периферических тканей, и 3) изучение обезболивающего / анти-hyperalgesic и противовоспалительным действиями Роман лекарств-кандидатов и интервенционных методов лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Microdialysis catheter | Tool | Dermal Dialysis | NA | |
| Pump 22 | Tool | Harvard Apparatus | 552219 | |
| Saalmann Multitester SBB LT 400 | Tool | Saalmann GmbH | NA | |
| RM-12 IP-65 Radiometer | Tool | Dr. Grobel UV Elektronik GmbH | 82120000/81112100 | |
| Complete Proteinase Inhibitor | Reagent | Roche Group | 11836145001 | |
| Microcent tube | Tool | E&K Scientific | 380150-X | |
| Albumin 5% | Reagent | ZLB Behring | NA | |
| Lactated Ringer | Reagent | Hospira Inc. | NA | |
| Xylocaine-MPF | Other | AstraZeneca | NA | |
| Syringe 1mL | Tool | BD Biosciences | 309602 |
References
- Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study. Pain. 139, 15-27 (2008).
