Summary
Une technique est présentée pour la collection in-vivo d'échantillons de liquide interstitiel des tissus à partir de sites pertinents (peau ici, expérimentalement enflammés) pour la mesure de médiation biochimiques douleur et l'inflammation.
Abstract
Ce bio-essai in vivo humaine peut être utilisée pour étudier des volontaires humains et des patients. Les échantillons sont prélevés à partir de sites pertinents, tels que les tissus de la peau via des cathéters insérés microdialyse aseptique (dialyse cutanée, Erlangen, Allemagne). Illustré dans cet exemple est la collection de liquide interstitiel de la peau enflammée expérimentalement chez des volontaires humains. Prélèvement d'échantillon peut être combiné avec d'autres tests expérimentaux. Par exemple, l'évaluation simultanée de produits biochimiques libérés localement et de la sensibilité subjective à un stimulus douloureux de la peau enflammée expérimentalement fournit l'essentiel biochimique et comportementale lien d'identifier des biomarqueurs de la douleur et l'inflammation. Présenté test dans l'organisme humain vivant permet de comprendre mécanistes dans les processus spécifiques de tissus sous-jacents des douleurs et / ou l'inflammation. La méthode est également bien adapté pour examiner l'efficacité des interventions existantes ou nouvelles - telles que de nouveaux candidats médicaments - ciblant le traitement des affections douloureuses et / ou inflammatoire. Cet article propose une description détaillée sur l'utilisation des techniques de microdialyse pour recueillir le liquide interstitiel lésion cutanée expérimentale enflammées des sujets de l'étude humaine. Les échantillons de liquide interstitiel sont généralement traitées avec l'aide de tests immunologiques multiplexe array billes permettant titrant jusqu'à 100 analytes dans des échantillons de faible volume de 50 microlitres.
Protocol
L'induction de l'inflammation expérimentale:
- Un coup de soleil au premier degré est induite chez les non-tanné la peau d'une cuisse avec l'aide d'un étalonnage, source de rayons ultraviolets B (Saalmann Multitester CFF LT 499, Saalmann GmbH, Hereford, Allemagne). Le coup de soleil est induite 24 heures avant de commencer une expérience microdialyse en appliquant trois fois la quantité de rayons UVB nécessaire pour causer des rougeurs complète de la peau exposée, ou trois fois la dose minimale érythémateuse (DME). Le MED est déterminé dans chaque sujet avant le lancement du projet. Livraison précise d'énergie est assurée avec un UV-mètre (12 RM, le Dr Grobel UV-Electronic GmbH, Ettlingen, Allemagne).
Cathéter et la collecte de l'échantillon:
- Préparer une aire de repos avec des gants stériles, 1 porte-aiguille stérile, une seringue 1cc embout Luer avec une jauge de 23 (G) l'aiguille, une seringue avec une aiguille 1cc 30G, 1% de lidocaïne, tampons d'alcool, 2x2 compresses de gaze stériles, cathéters microdialyse attachée à une fin à une aiguille 23G 4cm (dialyse cutanée, Erlangen, Allemagne), et des tubes de 1,5 ml de collecte Microcent (E & K Scientific, Santa Clara, CA.) avec une solution inhibiteur de protéase 4μl par échantillon 100 ul sur glace sèche. solution inhibiteur de la protéase est faite par instruction du fabricant en utilisant des comprimés inhibiteur de protéase cocktail (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Allemagne).
- Préparer une solution à 1% d'albumine humaine dans la solution de Ringer lactate et de l'attirer dans la seringue embout Luer 1cc, en veillant à l'absence de bulles d'air restant dans la seringue.
- Charger la seringue avec le 1% d'albumine humaine enrichie solution de Ringer lactate dans le berceau (microdialyse multi-seringue en rack, Harvard Apparatus, South Natick, MA) monté sur une pompe à perfusion de haute précision (pompe 22, Harvard Apparatus, South Natick, MA ). Assurez-vous que la barre de la pompe à perfusion de conduite de la seringue est en plein contact avec le piston de la seringue. Réglez le débit de la pompe après avoir vérifié que le diamètre de seringue a été correctement entré dans la pompe. Taux de perfusion couramment utilisés varient entre 2 à 4μl/min.
- Définir la zone que vous prévoyez pour recueillir votre échantillon à partir. Lors de l'échantillonnage d'une zone créée artificiellement enflammés, tels que les coups de soleil décrit ci-dessus, le plan sur l'insertion du cathéter au bord de l'insolation.
- Nettoyez une petite zone sur les bords opposés de la lésion, ou sur le site vous avez l'intention de recueillir votre échantillon à partir, avec l'alcool. Ces zones seront nettoyées à l'insertion prévu et les points de sortie pour le cathéter. Injecter juste assez lidocaïne intra-cutanée (en témoigne blanchissement de la peau à l'injection) sur ces sites afin de créer une bulle très petite taille (maximum de 2 mm). L'injection de quantité limitée tels des échanges intra-cutanée de lidocaïne à l'entrée et de sortie du cathéter de microdialyse ne devrait pas modifier les résultats de l'essai biologique, mais ne font l'insertion du cathéter significativement moins douloureuse pour les sujets de l'étude.
- Utiliser des techniques aseptiques, insérer le cathéter de microdialyse avec l'aide d'une aiguille 23G attachés sur toute la longueur de la zone de la peau explorées. La profondeur de l'insertion est à l'interface entre derme et l'hypoderme. Insertion à une profondeur suffisante peut être vérifié optiquement. Comme l'aiguille et le cathéter attachés sont déplacés vers l'avant, l'aiguille doit provoquer un peu de place-plissement de la peau ainsi que quelques blanchissement de la peau. Aucun saignement devrait se produire. Si le saignement ne se produit, cela indique que l'aiguille se trouve plus profond que prévu et la profondeur d'insertion doit être ajustée. Une fois que l'aiguille a été poussé à travers le point de sortie de la peau, rincer les cathéters avec 1% d'albumine enrichi solution de Ringer lactate jusqu'à ce que vous voyez gouttelettes le long de la longueur du cathéter. Ceci est fait en prenant soin d'insérer la fin aiguille d'une seringue (aiguille 23G) dans l'extrémité distale du cathéter de microdialyse et injectant lentement solution.
- Après le rinçage du cathéter tirez doucement sur l'aiguille pour nourrir le cathéter fixé par la peau. Une manipulation délicate est nécessaire parce que les cathéters sont de petit diamètre, et par conséquent fragile. Tirez le cathéter jusqu'à ce qu'il soit complètement à travers la peau, c'est à dire la base du tube en plastique intégrant plus de l'extrémité distale du cathéter touche la peau au point d'entrée. Comme mentionné ci-dessus, peu ou pas de saignements à la fin de la procédure confirme le positionnement du cathéter optimal.
- Fixez l'extrémité distale du cathéter à la pointe de l'aiguille de la seringue 23G de repos dans le rack de la pompe à perfusion. Les soins sont nécessaires pour éviter la perforation de l'aiguille à travers la paroi du cathéter, ce qui causerait des fuites potentielles.
- Couper l'aiguille à l'extrémité proximale du cathéter.
- En utilisant ¼ de pouce ruban rose, fixez le tube de 1,5 ml de collecte préparés Microcent à la peau à proximité du site de sortie du cathéter. Placez l'extrémité du cathéter dans le tube de collecte pour permettre la collecte des microdialysat. Démarrer la pompe de perfusion à r prédéterminésmangé et par intermittence vérifier que le volume livré et recueillies correspondent. Dans le cas où les volumes ne correspondent pas, la fuite du site d'entrée de peau doit être exclu (peut parfois être résolu en tirant sur la partie du cathéter qui est incorporé par les tubes en plastique plus étroitement sur le site d'entrée de peau). Alternativement, un cathéter peut être nécessaire de remplacer si les volumes livrés et recueillis ne correspondent pas.
- Une fois l'échantillonnage terminé, les échantillons sont placés sur la glace sèche jusqu'à ce stockage à -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'utilisation combinée des techniques de microdialyse et la technologie immuno multiplex est un précieux temps réel, in vivo bioessai humaine offrant un aperçu des événements biochimiques dans les tissus d'intérêt. Combiné avec des tests comportementaux tels que tests de douleur, la méthode permet d'étudier les interactions complexes des produits biochimiques médiation douleur et l'inflammation. La méthode est prometteuse pour 1) l'identification de biomarqueurs spécifiques de tissu médiation douleur et l'inflammation, 2) en fournissant un aperçu mécaniste dans la pathologie des conditions de douleur inflammatoire et chronique avec des tissus périphériques pathologie, et 3) explorer les actions analgésique / anti-hyperalgiques et anti-inflammatoires de nouveaux candidats-médicaments et les thérapies interventionnelles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Microdialysis catheter | Tool | Dermal Dialysis | NA | |
| Pump 22 | Tool | Harvard Apparatus | 552219 | |
| Saalmann Multitester SBB LT 400 | Tool | Saalmann GmbH | NA | |
| RM-12 IP-65 Radiometer | Tool | Dr. Grobel UV Elektronik GmbH | 82120000/81112100 | |
| Complete Proteinase Inhibitor | Reagent | Roche Group | 11836145001 | |
| Microcent tube | Tool | E&K Scientific | 380150-X | |
| Albumin 5% | Reagent | ZLB Behring | NA | |
| Lactated Ringer | Reagent | Hospira Inc. | NA | |
| Xylocaine-MPF | Other | AstraZeneca | NA | |
| Syringe 1mL | Tool | BD Biosciences | 309602 |
References
- Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study. Pain. 139, 15-27 (2008).
