Summary
وتقدم تقنية لجمع داخل الجسم الحي من عينات السائل الخلالي من المواقع ذات الصلة الأنسجة (الجلد هنا ، ملتهبة تجريبيا) لقياس المواد الكيميائية الحيوية وساطة الألم والالتهابات.
Abstract
ويمكن استخدام هذا الاختبار الأحيائي في الجسم الحي ، لدراسة الإنسان ومتطوعين من البشر المرضى. يتم جمع عينات من مواقع النسيج ذات الصلة مثل الجلد عن طريق القسطرة microdialysis إدراج جو معقم و مطهر (غسيل الكلى عن طريق الجلد ، الاحتفالات ، ألمانيا). يتضح من هذا المثال هو جمع السائل الخلالي من الجلد ملتهبة تجريبيا في متطوعين من البشر. ويمكن الجمع بين جمع العينات مع اختبارات تجريبية أخرى. على سبيل المثال ، وتقييم المواد الكيميائية الحيوية في وقت واحد من الافراج محليا والحساسية الذاتية للمحفزات مؤلمة في الجلد ملتهبة تجريبيا يتيح الحرجة البيوكيميائية السلوكي تصل إلى تحديد المؤشرات الحيوية من الألم والالتهابات. مقايسة المعروضة في الكائن البشري يعيشون يسمح البصيرة الآلي في عمليات محددة الأنسجة الكامنة وراء الألم و / أو الالتهابات. هو أيضا طريقة مناسبة تماما لدراسة فعالية التدخلات القائمة أو الرواية -- مثل المخدرات المرشحين جديدة -- تستهدف معالجة أوضاع مؤلمة و / أو التهابات. هذه المادة سوف تقدم وصفا مفصلا عن استخدام تقنيات microdialysis لجمع السائل الخلالي من آفة الجلد ملتهبة تجريبيا من الموضوعات دراسة الإنسان. عادة ما تتم معالجة عينات السائل الخلالي بمساعدة من مجموعة متعددة المناعية حبة السماح يعاير تصل إلى 100 analytes في عينات صغيرة في الحجم ونحو 50 microliters.
Protocol
تحريض التهاب التجريبية :
- يشتمل على حروق من الدرجة الأولى في غير المدبوغة الجلد من الفخذ مع المعونة من معايرة ، ومصدر الأشعة فوق البنفسجية B (Saalmann Multitester SBB LT 499 ، Saalmann محدودة ، هيرفورد ، ألمانيا). ويتسبب في حروق الشمس قبل 24 ساعة من بدء التجربة microdialysis بتطبيق ثلاثة أضعاف كمية الضوء فوق البنفسجية اللازمة ليسبب احمرار الجلد المكشوف كاملة ، أو ثلاثة أضعاف الحد الأدنى من الجرعة الاحمراري (MED). يتم تحديد MED في كل مادة قبل بدء الدراسة. وأكد التسليم دقيقة من الطاقة مع الأشعة فوق البنفسجية مترا (12 RM ، الدكتور Grobel الالكترونية للأشعة فوق البنفسجية محدودة ، Ettlingen ، ألمانيا).
التنسيب القسطرة وجمع العينة :
- تعد منطقة التدريج مع قفازات معقمة ، 1 حامل إبرة معقمة ، 1cc حقنة غيض luer مع قياس 23 (G) الإبرة ، المحاقن مع إبرة 1cc 30G ، 1 ٪ ليدوكائين ، ومسحات الكحول ، 2X2 منصات شاش معقم ، والقسطرات microdialysis المرفقة في واحدة نهاية لإبرة 23G 4cm (غسيل الكلى عن طريق الجلد ، الاحتفالات ، ألمانيا) ، و 1.5 مل من أنابيب جمع Microcent (E & K العلمية ، وسانتا كلارا ، كاليفورنيا.) مع 4μl مثبط البروتياز حل لكل عينة 100μl على الجليد الجاف. يتم حل مثبط البروتياز في تعليمات الشركة المصنعة باستخدام أقراص البروتيني كوكتيل المانع (روش تشخيص ، شركة محدودة ، مانهايم ، ألمانيا).
- إعداد 1 ٪ حل الزلال البشري في حل الجرس lactated واستدراجه الى حقنة 1cc غيض luer ، والتأكد من وجود فقاعات الهواء NO المتبقية في المحاقن.
- تحميل المحاقن مع 1 ٪ الإنسان حل رينغر الألبومين المخصب اكتات في المهد (microdialysis متعددة حقنة الرف ، جهاز هارفارد ، ناتيك الجنوبية ، MA) التي شنت على مضخة الدقة ضخ عالية (مضخة 22 ، هارفارد جهاز ، جنوب ناتيك ، MA ). تأكد من أن شريط للمضخة التسريب القيادة الحقنة على اتصال كامل مع المكبس من المحاقن. تعيين معدل ضخ بعد التأكد من أنه تم إدخال حقنة القطر بدقة في المضخة. معدلات ضخ تستخدم عادة تتراوح ما بين 2 إلى 4μl/min.
- تحديد المنطقة التي تخطط لجمع من عينتك. عندما أخذ عينات من المنطقة عن وملتهبة مصطنع ، مثل حروق الشمس وصفها أعلاه ، على إدراج خطة القسطرة على حافة حروق الشمس.
- تنظيف منطقة صغيرة على حواف المقابل من الآفة ، أو الموقع الذي تنوي جمع من عينتك ، مع الكحول. وسوف يتم تنظيف هذه المناطق الإدراج المقصودة ونقاط الخروج عن القسطرة. ضخ ما يكفي فقط ليدوكائين داخل cutaneously (بدليل تبييض الجلد على حقن) في هذه المواقع لخلق فقاعة صغيرة جدا (الحد الأقصى من 2mm و). وينبغي حقن كمية محدودة من هذا القبيل داخل جلدي يدوكائين في نقاط الدخول والخروج من القسطرة microdialysis لا يغير من نتائج الاختبار الأحيائي ولكن لا تجعل من الإدراج القسطرة بشكل ملحوظ أقل إيلاما لمواضيع الدراسة.
- باستخدام تقنيات العقيم ، إدراج القسطرة microdialysis مع المعونة من 23G إبرة تعلق على طول منطقة الجلد استكشافها. عمق الإدراج في واجهة بين جلدي وتحت الجلد. يمكن التحقق من الإدراج في عمق كاف بصريا. كما يتم نقل الإبرة والقسطرة إلى الأمام ينبغي أن تعلق الإبرة تسبب قليلا حتى للطي من الجلد فضلا عن بعض تبييض البشرة. لا ينبغي أن يحدث نزيف. إذا كان النزيف يحدث هذا يدل على أن تقع الإبرة أعمق مما هو مقصود وعمق الإدراج يجب أن يكون المعدل. مرة واحدة وقد تم دفع الإبرة في نقطة الخروج من الجلد ، مع تدفق القسطرة 1 ٪ الألبومين حل رينغر المخصب اكتات حتى تشاهد قطرات على طول القسطرة. يتم ذلك عن طريق إدراج بعناية نهاية إبرة حقنة (23G إبرة) في نهاية البعيدة للقسطرة microdialysis ، وحقن ببطء الحل.
- بعد التنظيف القسطرة برفق على الإبرة لتغذية المرفقة قسطرة من خلال الجلد. مطلوب التعامل مع طيف لأن القسطرة صغيرة القطر ، وبالتالي الهشة. سحب القسطرة حتى يتم مترابطة تماما من خلال الجلد ، أي قاعدة من أنابيب البلاستيك أكبر تضمين نهاية البعيدة للقسطرة تلامس الجلد عند نقطة الدخول. كما ذكر أعلاه ، تذكر لعدم وجود نزيف في نهاية الإجراء يؤكد الأمثل التنسيب القسطرة.
- نعلق نهاية البعيدة للقسطرة لغيض من إبرة المحقنة 23G من الراحة في الرف للمضخة الحقن في الوريد. مطلوب الحذر لتجنب ثقب الإبرة من خلال الجدار من القسطرة ، والتي تتسبب في تسرب محتمل.
- قطع الإبرة قبالة نهاية القريبة من القسطرة.
- ¼ بوصة باستخدام الشريط الوردي ، ونعلق على استعداد 1.5ml أنبوب جمع Microcent في الجلد بالقرب من موقع خروج القسطرة. مكان غيض من القسطرة في أنبوب للسماح للجمع مجموعة من microdialysate. بدء تشغيل مضخة نضح في ص سلفاأكلت والتحقق من أن حجم تسليمها بشكل متقطع وجمعت المباراة. في حالة وحدات التخزين لا تصل المباراة ، والتسرب من الجلد موقع دخول ينبغي استبعاد (أحيانا يمكن أن تحل عن طريق سحب جزء من القسطرة مضمن بواسطة أنابيب بلاستيكية أكثر إحكاما على الجلد موقع دخول). بدلا من ذلك ، قد تحتاج إلى قسطرة استبداله إذا سلمت وجمعت كميات لا تصل المباراة.
- بمجرد اكتمال أخذ العينات ، يتم وضع العينات في الثلج الجاف حتى في تخزين -80 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الجمع بين استخدام تقنيات متعددة microdialysis والتكنولوجيا المناعية هو قيمة في الوقت الحقيقي ، داخل الجسم الحي الأحيائي الإنسان توفير نظرة ثاقبة الأحداث البيوكيميائية في الأنسجة من الاهتمام. جنبا إلى جنب مع التجارب السلوكية مثل اختبارات الألم ، والأسلوب يسمح دراسة التفاعلات الكيميائية الحيوية المعقدة وساطة الألم والالتهابات. طريقة واعدة ل1) تحديد المؤشرات الحيوية أنسجة معينة وساطة الألم والالتهاب ، 2) توفير البصيرة الآلي في علم الأمراض من ظروف الألم والالتهاب المزمن مع أمراض الأنسجة الطرفية ، و 3) استكشاف إجراءات مسكنة / مكافحة مفرط التألم والمضادة للالتهابات من المرشحين المخدرات الرواية والعلاجات التداخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Microdialysis catheter | Tool | Dermal Dialysis | NA | |
| Pump 22 | Tool | Harvard Apparatus | 552219 | |
| Saalmann Multitester SBB LT 400 | Tool | Saalmann GmbH | NA | |
| RM-12 IP-65 Radiometer | Tool | Dr. Grobel UV Elektronik GmbH | 82120000/81112100 | |
| Complete Proteinase Inhibitor | Reagent | Roche Group | 11836145001 | |
| Microcent tube | Tool | E&K Scientific | 380150-X | |
| Albumin 5% | Reagent | ZLB Behring | NA | |
| Lactated Ringer | Reagent | Hospira Inc. | NA | |
| Xylocaine-MPF | Other | AstraZeneca | NA | |
| Syringe 1mL | Tool | BD Biosciences | 309602 |
References
- Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study. Pain. 139, 15-27 (2008).
