Summary
טכניקה מוצג אוסף ב-vivo של דגימות נוזל interstitial מאתרים רקמות רלוונטי (העור כאן, מוסת בניסוי) למדידת ביוכימיקלים מתווך כאב ודלקת.
Abstract
המבדק הזה ב-vivo האדם יכול לשמש כדי ללמוד מתנדבים אדם חולים. דוגמאות נאספים מאתרי רקמות רלוונטי כגון העור באמצעות קטטר מוכנס microdialysis בסביבה נקייה מחיידקים (דיאליזה Dermal, Erlangen, גרמניה). בדוגמה זו היא אוסף של נוזל interstitial של דלקת עור בניסוי במתנדבים אנושיים. אוסף דוגמאות ניתן בשילוב עם בדיקות ניסיוניות אחרות. לדוגמה, ההערכה סימולטני של ביוכימיקלים שוחרר מקומית רגישות סובייקטיבית לגירויים מכאיבים בעור מודלק בניסוי מספק את הקישור קריטי ביוכימיים התנהגותי לזהות סמנים ביולוגיים של כאב ודלקת. Assay שהוצגו האורגניזם האנושי החי מאפשר תובנה מכניסטית לתוך תהליכי רקמות ספציפיות הבסיסית והכאב / או דלקת. השיטה גם מתאימה מאוד כדי לבחון את היעילות של התערבויות קיימות או רומן - כמו לתרופות חדשות - מיקוד הטיפול של מצבים כואבים ו / או דלקתיים. מאמר זה יספק תיאור מפורט על שימוש בטכניקות microdialysis לאיסוף נוזלים ביניים מן הנגע בעור מודלק בניסוי של נבדקי המחקר האנושי. דגימות נוזל ביניים מעובדים בדרך כלל עם סיוע של חרוז זמנית immunoassays מערך המאפשר assaying עד 100 analytes בדגימות קטנות בהיקף כמו 50 מיקרוליטר.
Protocol
אינדוקציה של דלקת ניסיוני:
- כוויות שמש מדרגה ראשונה מושרה בעור הלא שזוף של הירך עם סיוע של מקור, כיול אולטרה סגולה-B (Saalmann Multitester SBB LT 499, Saalmann GmbH, הרפורד, גרמניה). כוויות שמש מושרה 24 שעות לפני תחילת ניסוי microdialysis ידי יישום שלוש פעמים את כמות האור UVB צורך לגרום מאדימים מלא של עור חשוף, או שלוש פעמים את מינון erythemal מינימלי (MED). MED נקבעת בכל נושא לפני תחילת המחקר. מסירה מדויקת של אנרגיה מובטח עם UV-מטר (12 RM, ד"ר Grobel UV-Electronic GmbH, Ettlingen, גרמניה).
צנתר השמה אוסף מדגם:
- הכנת שטח היערכות עם כפפות סטריליות, 1 בעל מחט סטרילית, מזרק 1cc luer טיפ עם מד 23 (G) מחט, מזרק 1cc עם מחט 30G, 1% לידוקאין, מטליות אלכוהול, 2x2 פדי גזה סטרילי, צנתרים microdialysis המצורפת באחד סוף מחט 23G 4cm (דיאליזה Dermal, Erlangen, גרמניה), ו - 1.5 מ"ל Microcent אוסף צינורות (E & K מדעי, סנטה קלרה, קליפורניה.) עם פתרון מעכב פרוטאז 4μl לדגימה 100μl על קרח יבש. מעכבי פרוטאז פתרון מורכב לכל הוראה של היצרן באמצעות מעכבי פרוטאז קוקטייל טבליות (Roche Diagnostics, GmbH, מנהיים, גרמניה).
- הכן פתרון 1% אלבומין אנושי פתרון הצלצול של lactated ולמשוך אותו לתוך המזרק luer 1cc קצה, מוודא שאין בועות אוויר שנותרו המזרק.
- טען את המזרק עם הפתרון של 1% אלבומין מועשר האדם לקטט של הצלצול לתוך העריסה (microdialysis רב מזרק מתלה, הרווארד Apparatus, דרום Natick, MA) רכוב על משאבת עירוי דיוק גבוהה (משאבה 22, הרווארד Apparatus, דרום Natick, MA ). ודאו כי הבר של משאבת עירוי הנהיגה את המזרק נמצא במגע מלא עם הבוכנה של המזרק. הגדר את קצב משאבת לאחר המאשר כי הקוטר מזרק הוזנו במדויק לתוך המשאבה. שיעורי עירוי בשימוש נפוץ נע בין 2 ל 4μl/min.
- הגדר את אזור אתה מתכנן לאסוף דגימת שלך. כאשר דגימה מאיזור דלקתי נוצר באופן מלאכותי, כגון כוויות שמש המתואר לעיל, תוכנית על החדרת צנתר בקצה כוויות שמש.
- ניקוי שטח קטן בקצוות מנוגדים של הנגע, או אתר אתה מתכוון לאסוף דגימת שלך, עם אלכוהול. אלו אזורים לנקות תהיה הכניסה נועדה ונקודות יציאה הקטטר. מספיק להזריק לידוקאין תוך cutaneously (שמעידים הלבנה של העור על זריקה) באתרים אלה כדי ליצור בועה קטנה מאוד (מקסימום של 2 מ"מ). הזרקה של כמות מוגבלת כזו של לידוקאין תוך עורית בכניסה ויציאה של הקטטר microdialysis לא צריך לשנות את תוצאות המבדק, אבל עושה החדרת הקטטר באופן משמעותי פחות כואב עבור משתתפי המחקר.
- באמצעות שימוש בטכניקות aseptic, הכנס את צנתרים microdialysis בעזרת מחט 23G מצורף לאורך האזור העור נחקרו. עומק הכניסה נמצאת בממשק שבין cutis ו subcutis. הכנסת בעומק נאותה ניתן לאמת אופטית. כאשר המחט הקטטר מחוברת מועברים קדימה המחט צריכה לגרום קצת למעלה קיפול של העור, כמו גם כמה הלבנה של העור. דימום לא אמור להתרחש. אם הדימום מתרחש זה מצביע על כך את המחט ממוקם עמוק יותר המיועדים ועומק הכניסה צריך להיות מותאם. לאחר מחט נדחקה דרך נקודת יציאה של העור, לשטוף את צנתרים עם פתרון 1% מועשר אלבומין לקטט של הצלצול עד שתראה טיפות לאורכו של הקטטר. הדבר נעשה על ידי החדרת בזהירות את קצה מחט של מזרק (מחט 23G) לתוך סוף דיסטלי של הקטטר microdialysis, ולאט לאט הזרקת פתרון.
- לאחר השטיפה הקטטר למשוך בעדינות את המחט כדי להאכיל את הקטטר מחוברת דרך העור. טיפול עדין נדרש כי צנתרים הם בקוטר קטן, וכתוצאה מכך ושברירי. משוך את הצנתר עד שהוא מושחל לחלוטין דרך העור, כלומר, הבסיס של צינורות הפלסטיק גדול הטבעה סוף דיסטלי של קטטר נוגע בעור בנקודת הכניסה. כאמור, מעט דימום לא בסוף ההליך מאשר המיקום האופטימלי קטטר.
- צרף את הקצה הדיסטלי של הקטטר אל קצה המחט 23G של מזרק המנוחה במעמד של משאבת אינפוזיה. טיפול נדרש כדי למנוע ניקוב את המחט דרך הקיר של הקטטר, אשר עלול לגרום דליפה פוטנציאליים.
- חותכים את המחט מקצה הפרוקסימלי של הקטטר.
- שימוש ¼ אינץ' סרט ורוד, לצרף את צינור מוכנים 1.5ml אוסף Microcent את העור קרוב לאתר את היציאה של קטטר. הניחו את קצה הצנתר לתוך הצינור אוסף לאפשר איסוף microdialysate. הפעל את המשאבה זלוף ב r מראשאכלו לסירוגין לבדוק נפח נמסר ואסף מתאימים. במקרה כרכים אינם מתאימים, זליגת מהאתר כניסה העור צריך להיות שליליים (לפעמים יכול להיפתר על ידי משיכת חלק קטטר המוטבע על ידי צינורות הפלסטיק חזק יותר על האתר כניסה העור). לחלופין, קטטר ייתכן שיהיה צורך להחליפו אם כרכים נמסר שנאספו אינם מתאימים.
- לאחר הדגימה היא מוחלטת, דגימות ממוקמים על קרח יבש עד אחסון ב -80 º C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השימוש בשילוב של טכניקות microdialysis ו immunoassay הטכנולוגיה זמנית הוא בעל ערך בזמן אמת, ב-vivo המבדק אדם מתן תובנה אירועים ביוכימיים ברקמות של עניין. בשילוב עם בדיקות התנהגותיות כגון בדיקות כאב, השיטה מאפשרת ללמוד את יחסי הגומלין המורכבים של ביוכימיקלים מתווך כאב ודלקת. השיטה מבטיחה 1) זיהוי סמנים ספציפיים רקמות מתווך כאב ודלקת, 2) מתן תובנה מכניסטית לתוך הפתולוגיה של התנאים כאב דלקתי כרוני עם רקמה לפתולוגיה הפריפריה, ו 3) לחקור פעולות משכך כאבים / אנטי hyperalgesic ואנטי דלקתיים של תרופה חדשנית מועמדים וטיפולים התערבותית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Microdialysis catheter | Tool | Dermal Dialysis | NA | |
| Pump 22 | Tool | Harvard Apparatus | 552219 | |
| Saalmann Multitester SBB LT 400 | Tool | Saalmann GmbH | NA | |
| RM-12 IP-65 Radiometer | Tool | Dr. Grobel UV Elektronik GmbH | 82120000/81112100 | |
| Complete Proteinase Inhibitor | Reagent | Roche Group | 11836145001 | |
| Microcent tube | Tool | E&K Scientific | 380150-X | |
| Albumin 5% | Reagent | ZLB Behring | NA | |
| Lactated Ringer | Reagent | Hospira Inc. | NA | |
| Xylocaine-MPF | Other | AstraZeneca | NA | |
| Syringe 1mL | Tool | BD Biosciences | 309602 |
References
- Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study. Pain. 139, 15-27 (2008).
