Summary
एक तकनीक दर्द और सूजन mediating जैव रसायनों की माप के लिए उचित ऊतक साइटों (यहाँ, प्रयोगात्मक सूजन त्वचा) से मध्य द्रव नमूनों के संग्रह में vivo के लिए प्रस्तुत किया है.
Abstract
इस में vivo मानव bioassay मानव स्वयंसेवकों और रोगियों के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Aseptically डाला microdialysis कैथेटर (त्वचीय डायलिसिस, अरलैंगेन, जर्मनी) के माध्यम से त्वचा के रूप में उचित ऊतक साइटों से नमूने एकत्र कर रहे हैं. इस उदाहरण में इलस्ट्रेटेड मानव स्वयंसेवकों में प्रयोगात्मक सूजन त्वचा से मध्य द्रव का संग्रह है. नमूना संग्रह अन्य प्रयोगात्मक परीक्षण के साथ संयुक्त किया जा सकता है है. उदाहरण के लिए, स्थानीय रूप से जारी biochemicals और प्रयोगात्मक सूजन त्वचा में दर्दनाक stimuli करने के लिए व्यक्तिपरक संवेदनशीलता के साथ - साथ मूल्यांकन महत्वपूर्ण जैव रासायनिक व्यवहार दर्द और सूजन के biomarkers की पहचान करने के लिए लिंक प्रदान करता है. ऊतक विशिष्ट दर्द और / या सूजन अंतर्निहित प्रक्रियाओं में रहने वाले मानव जीव में प्रस्तुत परख यंत्रवादी अंतर्दृष्टि के लिए अनुमति देता है. ऐसी नई दवा उम्मीदवार के रूप में - दर्दनाक और / या भड़काऊ शर्तों के उपचार के लक्ष्यीकरण विधि को भी अच्छी तरह से मौजूदा या उपन्यास हस्तक्षेप की प्रभावशीलता की जांच के अनुकूल है. यह आलेख microdialysis तकनीक के उपयोग पर मानव अध्ययन विषयों की प्रयोगात्मक सूजन त्वचा घाव से बीचवाला तरल पदार्थ इकट्ठा करने के लिए एक विस्तृत विवरण प्रदान करेगा. मध्य द्रव के नमूने आमतौर पर मल्टीप्लेक्स मनका सरणी के रूप में 50 microliters के रूप में मात्रा में छोटे नमूनों में 100 analytes परख करने की क्रिया की अनुमति immunoassays की सहायता के साथ संसाधित कर रहे हैं.
Protocol
प्रयोगात्मक सूजन का प्रेरण:
- एक पहली डिग्री धूप की कालिमा एक calibrated, पराबैंगनी बी स्रोत (Saalmann Multitester SBB LT 499, Saalmann GmbH, Hereford, जर्मनी) की सहायता से एक जांघ की गैर tanned त्वचा में प्रेरित है. धूप की कालिमा तीन बार आवेदन UVB प्रकाश की मात्रा को उजागर त्वचा की पूरी लाल होना, या तीन बार कम erythemal खुराक (मेड) के कारण के लिए आवश्यक के द्वारा एक microdialysis प्रयोग शुरू करने से पहले 24 घंटे प्रेरित है. मेड अध्ययन दीक्षा से पहले प्रत्येक विषय में निर्धारित किया जाता है. ऊर्जा का सटीक वितरण के साथ आश्वासन दिया है एक यूवी मीटर (आरएम 12, डा. Grobel यूवी इलेक्ट्रॉनिक GmbH, Ettlingen, जर्मनी).
कैथेटर प्लेसमेंट और नमूना संग्रह:
- बाँझ दस्ताने, 1 बाँझ सुई, 23 (G) गेज सुई, एक 30g सुई के साथ 1cc सिरिंज, 1% lidocaine के साथ 1cc luer टिप सिरिंज धारक के साथ एक मचान क्षेत्र तैयार करने के लिए, शराब swabs, 2x2 बाँझ धुंध पैड, microdialysis कैथेटर में संलग्न 4cm 23g (त्वचीय डायलिसिस, अरलैंगेन, जर्मनी), सुई और सूखी बर्फ पर 100μl नमूना प्रति 4μl protease अवरोध करनेवाला समाधान के साथ 1.5 मिलीलीटर Microcent संग्रह ट्यूब (ई एंड कश्मीर वैज्ञानिक, सांता क्लारा, CA के.) के लिए अंत. protease अवरोध करनेवाला समाधान निर्माता protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल गोलियाँ (Roche Diagnostics, GmbH, मैनहेम, जर्मनी) का उपयोग अनुदेश प्रति किया जाता है.
- Lactated है घंटी समाधान में एक 1% मानव albumin समाधान तैयार है और यह 1cc luer टिप सिरिंज में आकर्षित करने के लिए, यकीन है कि वहाँ कोई हवा सिरिंज में शेष बुलबुले हैं.
- लोड 1% मानव albumin समृद्ध घंटी पालने (microdialysis सिरिंज बहु रैक, हार्वर्ड उपकरण, दक्षिण Natick, एमए) एक उच्च परिशुद्धता जलसेक पंप (22 पम्प, हार्वर्ड उपकरण, दक्षिण Natick, एमए पर घुड़सवार में लैक्टेट समाधान के साथ सिरिंज ). निश्चित है कि जलसेक सिरिंज पंप ड्राइविंग के बार सिरिंज के सवार के साथ पूर्ण संपर्क में है. है कि सिरिंज व्यास सही पंप में प्रवेश दिया गया है की पुष्टि के बाद पंप दर सेट. आमतौर पर इस्तेमाल किया जलसेक दरों और 2 के बीच 4μl/min सीमा होती है.
- आप जिस क्षेत्र से अपने नमूना एकत्र करने की योजना को परिभाषित करें. जब एक कृत्रिम रूप से बनाया सूजन क्षेत्र, जैसे धूप की कालिमा ऊपर वर्णित है, धूप की कालिमा के किनारे पर कैथेटर डालने पर योजना से नमूने.
- घाव के विपरीत किनारों पर एक छोटा सा क्षेत्र है, या साइट पर आप से शराब के साथ अपने नमूना एकत्र करने का इरादा साफ. ये साफ क्षेत्रों का इरादा और कैथेटर के लिए सम्मिलन बाहर निकलें अंक हो जाएगा. सिर्फ पर्याप्त अंतर cutaneously lidocaine सुई (इंजेक्शन पर त्वचा के blanching द्वारा evidenced) इन साइटों पर एक बहुत छोटा सा छाला (2mm की अधिकतम) बनाने के. Microdialysis कैथेटर के प्रवेश और बाहर निकलें अंक में इस तरह के अंतर त्वचीय lidocaine के सीमित मात्रा में इंजेक्शन bioassay के परिणामों को बदल नहीं करता है, लेकिन काफी कम अध्ययन विषयों के लिए दर्दनाक कैथेटर की प्रविष्टि बनाने चाहिए.
- सड़न रोकनेवाला तकनीकों का प्रयोग, संलग्न 23g सुई की सहायता से पता लगाया त्वचा क्षेत्र की लंबाई पर microdialysis कैथेटर डालने. प्रविष्टि की गहराई cutis और subcutis के बीच इंटरफेस में है. पर्याप्त गहराई में निवेशन ऑप्टिकली सत्यापित किया जा सकता है. सुई और संलग्न कैथेटर के रूप में आगे ले जाया जाता है सुई के एक थोड़ा के रूप में अच्छी तरह के रूप में त्वचा के कुछ blanching त्वचा के ऊपर तह कारण होना चाहिए. कोई खून बह रहा हो जाना चाहिए. यदि खून बह रहा होती है यह इंगित करता है कि सुई गहरा लक्षित से स्थित है और सम्मिलन की गहराई को समायोजित किया जाना है. एक बार सुई त्वचा के बाहर निकलें बिंदु के माध्यम से धक्का दिया गया है 1% albumin समृद्ध रिंगर लैक्टेट समाधान के साथ कैथेटर फ्लश जब तक आप देख कैथेटर की लंबाई के साथ बूंदों. यह ध्यान microdialysis कैथेटर के बाहर अंत में एक सिरिंज (23g सुई) के अंत सुई डालने, और धीरे धीरे समाधान इंजेक्शन द्वारा किया जाता है.
- निस्तब्धता के बाद कैथेटर सुई पर धीरे से खींच त्वचा के माध्यम से संलग्न कैथेटर फ़ीड. क्योंकि कैथेटर छोटे व्यास, और फलस्वरूप नाजुक कोमल से निपटने की आवश्यकता है. कैथेटर खींचो जब तक यह पूरी तरह से त्वचा के माध्यम से लड़ी पिरोया है यानी, बड़े प्लास्टिक टयूबिंग कैथेटर के बाहर का अंत एम्बेड के आधार प्रवेश बिंदु पर त्वचा को छू. जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, प्रक्रिया के अंत में कोई खून बह रहा करने के लिए थोड़ा इष्टतम कैथेटर नियुक्ति की पुष्टि.
- सिरिंज जलसेक पंप के रैक में आराम के 23g सुई की नोक से कैथेटर के बाहर का अंत संलग्न. केयर कैथेटर की दीवार के माध्यम से सुई puncturing से बचने के लिए आवश्यक है, जो संभावित रिसाव का कारण होगा.
- कैथेटर की प्रॉक्सिमल अंत बंद सुई कट.
- ¼ इंच गुलाबी टेप का प्रयोग, कैथेटर के निकास साइट के पास त्वचा पर तैयार 1.5ml Microcent संग्रह ट्यूब देते हैं. संग्रह ट्यूब में कैथेटर की नोक प्लेस microdialysate के संग्रह की अनुमति. पूर्व निर्धारित r पर छिड़काव पंप प्रारंभखाया और रहकर जांच कि दिया और एकत्र मात्रा मैच. मामले में संस्करणों से मेल नहीं खाती है, त्वचा प्रविष्टि साइट से रिसाव (कभी कभी कैथेटर का हिस्सा है कि प्लास्टिक टयूबिंग द्वारा एम्बेडेड अधिक त्वचा प्रविष्टि साइट पर कसकर खींच द्वारा हल किया जा सकता है) बाहर रखा जाना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, एक कैथेटर के लिए जगह की जरूरत है अगर दिया और एकत्र मात्रा मेल नहीं खाते सकता है.
- एक बार नमूना पूरा हो गया है, नमूने का भंडारण तक सूखी बर्फ पर -80 º सी. पर रखा जाता है
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Discussion
microdialysis तकनीक और मल्टीप्लेक्स immunoassay प्रौद्योगिकी के संयुक्त उपयोग एक मूल्यवान वास्तविक समय में vivo मानव हित के ऊतकों में जैव रासायनिक घटनाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान bioassay है. दर्द परीक्षण के रूप में व्यवहार परीक्षण के साथ संयुक्त, विधि दर्द और सूजन mediating जैव रसायनों के जटिल संबंधों का अध्ययन करने की अनुमति देता है. विधि 1 के लिए वादा किया है) ऊतक विशिष्ट दर्द और सूजन, 2) mediating परिधीय ऊतक विकृति के साथ सूजन और क्रोनिक दर्द शर्तों के विकृति में यंत्रवादी अंतर्दृष्टि प्रदान बायोमार्कर की पहचान, और 3) के एनाल्जेसिक / विरोधी hyperalgesic और विरोधी भड़काऊ कार्रवाई की खोज उपन्यास दवा उम्मीदवारों और interventional उपचार.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Microdialysis catheter | Tool | Dermal Dialysis | NA | |
| Pump 22 | Tool | Harvard Apparatus | 552219 | |
| Saalmann Multitester SBB LT 400 | Tool | Saalmann GmbH | NA | |
| RM-12 IP-65 Radiometer | Tool | Dr. Grobel UV Elektronik GmbH | 82120000/81112100 | |
| Complete Proteinase Inhibitor | Reagent | Roche Group | 11836145001 | |
| Microcent tube | Tool | E&K Scientific | 380150-X | |
| Albumin 5% | Reagent | ZLB Behring | NA | |
| Lactated Ringer | Reagent | Hospira Inc. | NA | |
| Xylocaine-MPF | Other | AstraZeneca | NA | |
| Syringe 1mL | Tool | BD Biosciences | 309602 |
References
- Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study. Pain. 139, 15-27 (2008).
