Summary
המבחן גבוהות מבוך פלוס הוא אחד המבחנים הנפוצים ביותר למדידת חרדה כמו התנהגות בעכברים. כאן, אנו מציגים סרט המראה את הליכי מפורט לביצוע הבדיקה.
Abstract
למרות גנום העכבר עכשיו רצף לחלוטין, פונקציות של רוב הגנים מתבטאת במוח אינם ידועים. השפעתו של גן מסוים על התנהגות מסוימת יכול להיקבע על ידי ניתוח התנהגות של עכברים שעברו מוטציה. אם גן היעד מתבטאת במוח, פנוטיפ התנהגותי של עכברים שעברו מוטציה יכולה להבהיר את המנגנון הגנטי של התנהגות נורמלית. המבחן גבוהות מבוך פלוס הוא אחד המבחנים הנפוצים ביותר למדידת חרדה כמו התנהגות. הבדיקה מבוססת על שנאת הטבעי של העכברים עבור שטחים פתוחים גבוהות, כמו גם על ההתנהגות הטבעית שלהם גישוש ספונטנית בסביבות רומן. מנגנון מורכב בזרועות פתוחות וידיים סגור, חצה באמצע בניצב זה לזה, ואזור המרכז. עכברים מקבלים גישה לכל הזרועות ואת רשאים לנוע בחופשיות ביניהן. מספר כניסות לזרועות לפתוח את משך הזמן בזרועות פתוחות משמשים מדדי החרדה הנגרמת שטח פתוח בעכברים. למרבה הצער, את ההבדלים הקיימים בין פרוצדורליים מעבדות להקשות כפולות להשוות תוצאות בין מעבדות. כאן, אנו מציגים סרט מפורט הוכחת פרוטוקול שלנו למבחן מבוך גבוהות בתוספת. במעבדה שלנו, יש לנו להעריך יותר מ -90 זנים של עכברים מוטנטים באמצעות פרוטוקול שמוצג בסרט. נתונים אלה יחשף כחלק מסד נתונים ציבורי שעכשיו אנחנו בונים. ויזואליזציה של פרוטוקול יקדם הבנה טובה יותר של הפרטים של הליך הניסוי כולו, המאפשר סטנדרטיזציה של הפרוטוקולים המשמשים מעבדות השוואות שונות של פנוטיפים התנהגותיים של זנים שונים של עכברים מוטנטים הוערכה באמצעות בדיקה זו.
Protocol
פרוטוקול
- המנגנון המשמש מבחן מבוך גבוהות בתוספת היא בתצורה של + וכולל שתי זרועות פתוחות (25 x 5 x 0.5 ס"מ) זה מול זה ו בניצב שתי זרועות סגור (25 x 5 x 16 ס"מ) עם מרכז פלטפורמה (5 x 5 x 0.5 ס"מ). בזרועות פתוחות יש קטן מאוד (0.5 ס"מ) לקיר כדי להקטין את מספר נפילות, בעוד הזרועות סגור יש קיר גבוה (16 ס"מ) כדי להקיף את הזרוע. המנגנון כולו הוא 50 ס"מ מעל הרצפה (אוהרה ושות', טוקיו) ממוקם מיכל עגול ריק (100 ס"מ קוטר, 35 ס"מ, המשמש בדרך כלל את המשימה מבוך המים מוריס) כדי להגן על עכברים או ליפול ניסיון להימלט במהלך הניסוי. מנגנון מורכב של חומרים פלסטיים. המצע הוא לבן והקירות שקופים. קיימת שונות חומרים וצבעים של מנגנון המבוך פלוס גבוהות.
- עכברים הם שוכנו עם אור 12-h / מחזור כהה (אורות בשעה 07:00), כפי שתואר לעיל (טאקאו & Miyakawa, 2006a). הבדיקה מבוצעת ההתנהגות 9:00-18:00. כל עכברי הניסוי מועברים לבדיקת התנהגות 30 דקות בחדר לפני תחילת המשפט הראשון להרגיל למצב של החדר בדיקות התנהגות. הצו של ניסויים היא counterbalanced ברחבי גנוטיפים. ישנן שתי מטרות המשפט לבחון באמצעות בעלי חיים בפועל. האחת היא כדי לוודא שהכל בסדר עם מערכת הקלטה. נוספת היא להשאיר את המצב כמו בדיקה אחידה ככל האפשר. כלומר, את העכבר הראשון במפגש כולו היה חוויה מצב שונה במקצת עם אחרים (כלומר, אין רעשים לפני שנעשו על ידי פעולות בדיקה ואין רמזים ריח ממחקרים קודמים) ללא משפט כזה בפועל. בעלי חיים מתוחזקים על פי הנחיות ועדת בעלי חיים למחקר מאוניברסיטת קיוטו.
- בדיקות בחדר התנהגות (170 x 210 x 200 ס"מ, אוהרה ושות', טוקיו) היא לרעש ורמת תאורה נשמר 100 לוקס. העכבר ממוקם באזור המרכז של המבוך עם ראשו מופנה כלפי הזרוע סגור. הבדיקה גבוהות מבוך פלוס מוקלט באמצעות מצלמת וידאו המחוברת למחשב, אשר נשלטת על ידי התקן מרוחק. מספר הערכים (ערך מוגדר מרכז המסה של העכבר נכנס הזרוע) לתוך כל זרוע ואת משך הזמן בזרועות פתוחות נרשמות מדידות אלה משמשים כמדד להתנהגות חרדה וכדומה.
- עכברים רשאים לנוע בחופשיות על המבוך של 10 דקות. העכבר מקבל משפט אחד של הסוללה הבדיקה שלנו. היישום משמש עבור רכישת וניתוח נתונים התנהגותיים (תמונה EP) מבוססת על תוכנית J הציבור תמונה תחום (שפותחה על ידי ויין Rasband במכון הלאומי לבריאות הנפש וזמין בכל http://rsb.info.nih.gov/ ij / ), אשר שונה על ידי Tsuyoshi Miyakawa (זמין באמצעות אוהרה ושות', טוקיו, יפן).
- המרחק נסע, מספר כניסות לתוך כל זרוע, הזמן המושקע בכל זרוע, ועל אחוז כניסות לזרועות לפתוח מחושבים על ידי התוכנית EP תמונה.
- אחרי כל משפט, כל הזרועות ואזור מרכז מנקים עם מים hypochlorous סופר, כי הוא סוכן יעיל להסרת ריח ויש לו ריח חלש יחסית של עצמו לעומת פתרונות ניקוי אחרים, כדי למנוע הטיה על בסיס רמזים חוש הריח. כך אנו יכולים לנהל את הבדיקות בתנאים מבוקרים רמזים לגבי הריח.
Discussion
למרות גנום העכבר כבר רצף, פונקציות של מרבית הגנים אינם ידועים. בטכניקות הנדסה גנטית לאפשר מחיקה או מניפולציות אחרות של גן מסוים בעכברים (אוסטין et al, 2004;.. Aiba et al, 2007). השפעתו של גן מסוים על התנהגות ספציפית אז יכול להיות נקבע על ידי ביצוע ניתוח התנהגותי של עכברים שעברו מוטציה (טאקאו ו Miyakawa, 2006b;. טאקאו et al, 2007).
המבחן גבוהות מבוך פלוס הוא אחד המבחנים הפופולריים ביותר של כל הדגמים הזמינים כיום חיה של חרדה (רוג'רס Dalvi, 1997; קרולי, 2007). בדיקה זו של חרדה, כמו התנהגות שימש במשך ההקרנה phenotyping מהונדס ו נוקאאוט בעכברים (קרולי, 1999) ועל גילוי סמים (הוג et al 1996;. קרולי, 2007). המבחן גבוהות מבוך פלוס יש תוקף ניבוי חזק לסינון תרופות לטיפול בחרדות (רוג'רס Dalvi, 1997; Mechiel Korte דה בואר, 2003; קרולי, 2007); תרופות לטיפול בחרדות במיוחד להגדיל, ותרופות anxiogenic במיוחד להקטין את מספר הכניסות בזרועות פתוחות את הזמן שם. ציון ערכי מוחלט שהמרחק הכולל נחשבים מדד שימושי הפעילות הכללית. סה"כ ניקוד ערכים גם אינדקס של חרדה, אחוזי הכניסות הזמן המושקע בכל זרוע מהווים מדד של חרדה ראשונית (רוג'רס Dalvi, 1997, Mechiel Korte דה בואר, 2003). זרועות פתוחים וסגורים נחשבים לעורר את הכונן גישוש אותו, ולכן הימנעות נשק הפתוח נחשב תוצאה של אינדוקציה של רמות גבוהות יותר של פחד (רוג'רס Dalvi, 1997). הוא חשב כי סלידה של עכברים לחקור את בזרועות פתוחות המבוך נגרמת על ידי פחד ממקומות פתוחים גבוהות.
בשנת 1984, דיווחו הנדלי ו Mithani על עבודה ראשונית עם המבחן מבוך גבוהות (פלוס) X שתוארו לעיל. מנגנון הבדיקה המקורית הועלתה 70 ס"מ מעל הרצפה, כלל שני סגור בשתי זרועות פתוחות, שכל אחד מהם נמדד 45 ס"מ על 10 ס"מ רוחב. בשנת הלימודים הראשונה שלהם, הם דיווחו על יחס פתוח / סה"כ כניסות הזרוע (ו Mithani הנדלי, 1984). כתוצאה מכך, פותחו מדדים אחרים שכללו את מספר הערכים לזרועות סגור לפתוח את משך הזמן בזרועות סגור פתוח חולדות (Pellow et al, 1985; Pellow ואת קובץ, 1986) ועכברים (ליסטר, 1987) .
שינויים מבחן מבוך גבוהות בתוספת כלל התארכות של שני בזרועות פתוחות (50 x 10 ס"מ) נשק סגור (50 x 10 x 40 ס"מ) עם קירות גבוהים סביב גג פתוח על הזרועות סגור, המבוך כולו היה גבוה עד לגובה של 50 ס"מ (Pellow et al, 1985; Pellow ואת קובץ, 1986). נכון להיום, במעבדה שלנו, לבדוק את מוגבה בתוספת מנגנון מבוך מוגדר בצורת +, עם שתי זרועות פתוחות (25 x 5 ס"מ, עם מעט מאוד, 0.5 ס"מ, קיר) זה מול זה ו בניצב לשני הזרועות סגורות (25 x 5 x 16 ס"מ), והוא העלה 50 ס"מ מעל הרצפה (Miyakawa et al, 1996; Manabe et al, 2000; Miyakawa et al, 2001; סיגר et al, 2004; Morishima et al, 2005; מיאמוטו et al, 2005; חץ et al, 2006; האטורי et al, 2007; נימן et al, 2007; סנו et al, 2008; Horii et al, 2008; פוקודה et al, 2008; איקדה ואח'; 2008). העכבר ממוקם במרכז + (5 ס"מ X 5 ס"מ), והוא רשאי לחקור את מבוך בחופשיות. למרות 5 דקות הקלטה נפוצה, התנהגות נרשם דקות 10 בפרוטוקול שלנו להגדיל את ההזדמנות לזהות את הפנוטיפ. הנשק גבוהות פתוחים וסגורים לגרום סכסוך חקירה (Mechiel Korte דה בואר, 2003; קרולי, 2007).
הצעדים של מבחן מבוך גבוהות בתוספת נרשמות על ידי משקיף במהלך הניסוי. במעבדה שלנו, המבחן הוא הקליט עם מצלמת וידאו המחוברת למחשב את נתוני התנהגות (תמונה EP) נרכשים ונותחו באמצעות תוכנת ה-EP תמונה. מספר הרשומות על גבי בזרועות פתוחות לעומת מספר הערכים זרוע הכולל, ואת משך הזמן על הידיים בזרועות פתוחות לעומת סגורות, לספק מדדים של התנהגות, כמו חרדה.
החוקרים העריכו יותר מ -90 זנים של עכברים מהונדסים גנטית מוטציה באמצעות פרוטוקול שמוצג בסרט יש קבוצה גדולה של נתונים גולמיים עבור יותר מ 5000 עכברים (כולל wild-type ועכברים שעברו מוטציה). בשנת סוללה הבדיקה שלנו, wild-type להמלטה משמשים בדרך כלל כביקורת. כמו זן רקע, עכברים C57BL/6J נמצאים בשימוש נרחב. אספנו את הנתונים של עכברים C57BL/6J במבחני התנהגות. הערכים שהתקבלו בעכברים C57BL/6J במבחן מבוך פלוס גבוהות שלנו הם כדלקמן (n = 914; מתכוון SEM), המרחק הכולל נסע: 1547.55 14.27 ס"מ, משך הזמן המושקע: 56.49 2.42 s (בזרועות פתוחות), 384.02 3.13 s (נשק סגור), 161.90 2.17 s (מרכז מבוך); היחס בין משך הזמן בזרועות פתוחות: 9.19 0.36%, היחס בין משך הזמן בזרועות סגורות: 63.82 0.52%, מספר כניסות: 7.64 0.21 (בזרועות פתוחות), 24.32 0.28 (נשק סגור); פתוח% ערכים זרוע: 21.9 0.05,% סגור נשק ערכים: 78.1 0.05. עכברים C57BL/6J לבלות פחות זמן בזרועות פתוחות מאשר בזרועות סגורות (p <0.0001, N = 914, לזווג-t test). זה מעיד כי עכברים C57BL/6J נוטים להימנע בזרועות פתוחות, וכי משך הזמן בזרועות פתוחות הוא מדד תקף של התנהגות, כמו חרדה. בנוסף, בסדר גודל של ניסויים היא counterbalanced ברחבי גנוטיפים, משום שמספר המשפט משפיע על משך הזמן בזרועות פתוחות את פלטפורמת מרכז. כלומר, כל עלייה במדדי במהלך עכברים 3 ו - 4 לעומת 1 עכברים (p = 0.0089, n = 476) (נתונים לא פורסם). עם פרוטוקול שלנו, ניתוח של יותר מ 1661 בעכברים הראו כי בסדר רציף של עכברים שנבדקו בכלוב לא השפיעו באופן משמעותי על הזרוע לפתוח להישאר זמן (נתונים שלא פורסמו). כלומר, הופעות של עכברים ראשונים שננקטו מהכלוב לא שונה באופן משמעותי מאלה של השני, השלישי או עכברים האחרון.
למרות הבדיקה גבוהות מבוך פלוס המבחן אור / חושך המעבר הן בשימוש להערכת חרדה כמו התנהגות, התוצאות הן לא תמיד עקבי ביניהם (הולמס et al, 2000; Tujimura et al, 2008; Nakajima et al, in press ) לדוגמה, forebrain ספציפי calcineurin-נוקאאוט בעכברים להשקיע סכום קטן של זמן בחדר אור במבחן אור / חושך המעבר, אך כמות מוגברת של זמן בזרועות פתוחות במבחן מבוך גבוהות החיבור (Miyakawa et al. , 2003). ניתוח פקטור של הסוללה מבחן ההתנהגות שלנו עולה כי הבדיקה גבוהות מבוך פלוס המבחן אור / חושך מעבר להעריך אספקטים שונים של התנהגות, כמו חרדה, כגון חרדה בהיר מרחב במבחן אור / חושך המעבר פתוח חלל חרדה כמו התנהגות במבחן שדה פתוח (טאקאו ו Miyakawa, 2006b; Yamasaki et al, 2006). לפיכך, הן במבחן אור / חושך המעבר במבחן גבוהות מבוך פלוס כלולים סוללה מבחן ההתנהגות שלנו.
קראב ועמיתיו דיווחו כי משתנים מבוקרת ניסויים ואפיון מוטנטים עשוי להניב תוצאות ספציפיים מעבדה מסוים (קראב et al., 1999). ההבדלים הקיימים בין פרוצדורליים מעבדות להקשות לשכפל או להשוות את התוצאות ביניהן. הקמת תיעוד חזותי של פרוטוקול יקדם הבנה טובה יותר של הפרוצדורות, המאפשר סטנדרטיזציה של פרוטוקולים להשתמש בה בכל מעבדות להשוואות של פנוטיפים התנהגותיים של זנים שונים של עכברים מוטנטים הוערכה באמצעות בדיקות אלה. אנחנו קודם לכן פרסם פרוטוקול הסרט הבדיקה אור / חושך המעבר (טאקאו ו Miyakawa, 2006a). כמו כן, סרטים של פרוטוקולים אחרים, כגון למבחן שדה פתוח, porsolt אילצו מבחן לשחות, מיזוג פחד בדיקות שאנו משתמשים בסוללה מבחן ההתנהגות שלנו כיום נעשה עבור פרסום מאמרים כמו עתיד וידאו.
Disclosures
כל ההליכים אושרו על ידי שימוש בבעלי חיים ועדת Care מאוניברסיטת קיוטו.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים-in-Aid למחקר מדעי של האגודה יפן לקידום המדע (JSPs), גרנט-in-Aid ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה ביפן, מענקים ב- סיוע מן הציפור CREST של יפן המדע והטכנולוגיה הסוכנות, גרנט-in-Aid מ Neuroinformatics יפן מרכז (NIJC), RIKEN ועל ידי סיוע גרנט-in-למחקר מדעי על תחומי מחקר אינטגרטיבית-Brain עדיפות (Shien) - החל ב MEXT יפן. אנו מודים אוהרה ושות' מריקו הייאשי עזרתם ביצירת הסרט הזה.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Elevated plus maze | Tool | O’hara Co. | (none) |
References
- Takao, K., Miyakawa, T. Light/dark transition test for mice. J Vis Exp. , (2006).
- Aiba, A. Mouse liaison for integrative brain research. Neurosci Res. 58, 103-104 (2007).
- The knockout mouse project. Nat Genet. 36, 921-924 (2004).
- Takao, K., Miyakawa, T. Investigating gene-to-behavior pathways in psychiatric disorders: the use of a comprehensive behavioral test battery on genetically engineered mice. Ann N Y Acad Sci. 1086, 144-159 (2006).
- Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Impact of brain-behavior phenotyping of genetically-engineered mice on research of neuropsychiatric disorders. Neurosci Res. 58, 124-1232 (2007).
- Crawley, J. N. What's Wrong With My Mouse? Behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , 2nd edition, John Wiley and Sons. New York. 240 (2007).
- Rodgers, R. J., Dalvi, A. Anxiety, defense and the elevated plus-maze. Neurosci Behav Rev. 21, 801-810 (1997).
- Handley, S. L., Mithani, S. Effects of alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze-exploration model of 'fear'-motivated behaviour. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 324, 1-5 (1984).
- Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. J Neurosci Meth. 14, 149-167 (1985).
- File, S. E., Pellow, S. The effects of triazolobenzodiazepines in two animal tests of anxiety and in the holeboard. Br J Pharmac. 86, 729-7235 (1985).
- Lister, R. G. The use of a plus-maze to measure anxiety in the mouse. Psychopharmacology. 92, 180-185 (1987).
- Miyakawa, T., Yagi, T., Kagiyama, A., Niki, H. Radial maze performance, open-field and elevated plus-maze behaviors in Fyn-kinase deficient mice: further evidence for increased fearfulness. Brain Res Mol Brain Res. 37, 145-150 (1996).
- Manabe, T. Loss of cadherin-11 adhesion receptor enhances plastic changes in hippocampal synapses and modifies behavioral responses. Mol Cell Neurosci. 15, 534-546 (2000).
- Miyakawa, T., Yamada, M., Duttaroy, A., Wess, J. Hyperactivity and intact hippocampus-dependent learning in mice lacking the M1 muscarinic acetylcholine receptor. J Neurosci. 21, 5239-5250 (2001).
- Seeger, T. M2 muscarinic acetylcholine receptor knockout mice show deficits in behavioral flexibility, working memory, and hippocampal plasticity. J Neurosci. 24, 10117-10127 (2004).
- Morishima, Y. Enhanced cocaine responsiveness and impaired motor coordination in metabotropic glutamate receptor subtype 2 knockout mice. Proc Natl Acad Sci USA. 102, 4170 (2005).
- Miyamoto, T. Tight junctions in Schwann cells of peripheral myelinated axons: a lesson from claudin-19-deficient mice. J Cell Biol. 169, 527-538 (2005).
- NFAT dysregulation by increased dosage of DSCR1 and DYRK1A on chromosome 21. Nature. 441, 595-600 (2006).
- Hattori, S. Enriched environments influence depression-related behavior in adult mice and the survival of newborn cells in their hippocampi. Behav Brain Res. 180, 69-76 (2007).
- Niemann, S. Genetic ablation of NMDA receptor subunit NR3B in mouse reveals motoneuronal and non-motoneuronal phenotypes. Europ J Neurosci. 26, 1407-1420 (2007).
- Sano, H., Nagai, Y., Miyakawa, T., Shigemoto, R., Yokoi, M. Increased social interaction in mice deficient of the striatal medium spiny neuron-specific phosphodiesterase 10A2. J Neurochem. 105, 546-556 (2008).
- Horii, Y., Yamasaki, N., Miyakawa, T., Shiosaki, S. Increased anxiety-like behavior in neuropsin (kallikrein-related peptidase 8) gene-deficient mice. Behav Neurosci. 122, 498-504 (2008).
- Fukuda, E. Down-regulation of protocadherin-α, A isoforms in mice changes contextual fear conditioning and spatial working memory. Eur J Neurosci. , In Press Forthcoming.
- Ikeda, M. Identification of YWHAE, a gene encoding 14-3-3epsilon, as a possible susceptibility gene for schizophrenia. Behav Neurosci. , In Press Forthcoming.
- Korte, S. M., De Boer, S. F. A robust animal model of state anxiety: fear-potentiated behaviour in the elevated plus-maze. Eur J Phamacol. 463, 163-175 (2003).
- Hogg, S. A review of the validity and variability of the elevated plus-maze as an animal model of anxiety. Pharmacol Biochem Behav. 54, 21-30 (1996).
- Holmes, A., Parmigiani, S., Ferrari, P. F., Palanza, P., Rodgers, R. J. Behavioral profile of wild mice in the elevated plus-maze test for anxiety. Physiol Behav. 71, 509-516 (2000).
- Tsujimura, A., Matsuki, M., Takao, K., Yamanishi, K., Miyakawa, T., Hashimoto-Gotoh, T. Mice lacking the kf-1 gene exhibit increased anxiety- but not despair-like behavior. Front. Behav. Neurosci. 10, In Press (2008).
- Nakajima, R., Takao, K., SM, H. uang, Takano, J., Iwata, N., Miyakawa, T., Saido, T. C. Comprehensive Behavioral Phenotyping of Calpastatin-Knockout Mice. Molecular Brain. , In Press Forthcoming.
- Miyakawa, T. Conditional calcineurin knockout mice exhibit multiple abnormal behaviors related to schizophrenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 8987-8992 (2003).
- Factor analyses of large-scale data justify the behavioral test battery strategy to reveal the functional significances of the genes expressed in the brain. Yamasaki, N. The 36th Annual Meeting of the Society for Neuroscience, 2006 October 14–18, Atlanta, Georgia, , Program number 100.15, Poster Number PP32 (1985).
- Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. Genetics of mouse behavior: interactions with laboratory environment. Scienc. 284, 1670-1672 (1999).
