Summary
O teste de labirinto em cruz elevado é um dos testes mais utilizados para medir a ansiedade-como o comportamento em camundongos. Aqui, apresentamos um filme mostrando os procedimentos detalhados para a realização do ensaio.
Abstract
Embora o genoma do rato é agora completamente seqüenciado, as funções da maioria dos genes expressos no cérebro não são conhecidos. A influência de um determinado gene em um comportamento específico pode ser determinado pela análise comportamental de ratos mutantes. Se um gene alvo é expressa no cérebro, fenótipo comportamental dos camundongos mutantes poderiam elucidar o mecanismo genético de comportamentos normais. O teste de labirinto em cruz elevado é um dos testes mais utilizados para medir a ansiedade-como o comportamento. O teste se baseia na aversão natural de ratos para áreas abertas e elevados, bem como sobre o seu comportamento espontâneo naturais exploratório em ambientes novos. O aparelho consiste de braços abertos e os braços fechados, cruzou no meio perpendicularmente uns aos outros, e uma área central. Ratos têm acesso a todas as armas e estão autorizados a circular livremente entre eles. O número de entradas nos braços abertos eo tempo gasto nos braços abertos são usados como índices de ansiedade induzida espaço aberto em camundongos. Infelizmente, as diferenças que existem entre processuais laboratórios torná-lo difícil de duplicar e comparar os resultados entre laboratórios. Aqui, apresentamos um filme detalhado demonstrando nosso protocolo para o teste de labirinto em cruz elevado. Em nosso laboratório, temos avaliados mais de 90 linhagens de camundongos mutantes usando o protocolo mostrado no filme. Estes dados serão divulgados como parte de um banco de dados público que estamos construindo. Visualização do protocolo irá promover uma melhor compreensão dos detalhes de todo o procedimento experimental, permitindo a padronização dos protocolos utilizados em laboratórios diferentes e as comparações dos fenótipos comportamentais de várias linhagens de ratos mutantes avaliados através deste teste.
Protocol
Protocolo
- O aparelho utilizado para o teste de labirinto em cruz elevado é na configuração de um + e compreende dois braços abertos (25 x 5 x 0,5 cm) em frente a si e perpendiculares a dois braços fechados (25 x 5 x 16 cm) com um centro de plataforma (5 x 5 x 0,5 cm). Os braços abertos têm uma pequena parede (0,5 cm) para diminuir o número de quedas, enquanto os braços fechados e uma parede (16 cm) de altura para colocar o braço. Todo o aparelho é de 50 cm acima do piso (Ohara & Co., Tokyo) e é colocado em um tanque vazio circular (100 cm de diâmetro, 35 cm de altura, normalmente utilizada para a tarefa de labirinto aquático de Morris) para proteger os ratos que caem ou tentativa de fuga durante o experimento. O aparelho é feito de materiais plásticos. A plataforma é branco e as paredes são transparentes. Há uma variação de materiais e cores dos aparelhos de labirinto elevado.
- Os ratos são alojados com uma luz de 12 h / ciclo escuro (luzes acesas às 07:00), como descrito anteriormente (Takao & Miyakawa, 2006a). Testes comportamentais é realizada 09h00 - 18:00. Todos os camundongos experimental são transferidos para a sala de testes de comportamento min 30 antes de começar o primeiro teste para habituar à condição da sala de testes de comportamento. A ordem dos ensaios é contrabalançada em genótipos. Há dois fins de julgamento de teste usando um animal prática. Uma delas é para se certificar de que está tudo bem com o sistema de gravação. Outra é manter a condição de teste mais uniforme possível. Ou seja, o mouse primeiro em toda a sessão seria condição experiência um pouco diferente com os outros (isto é, sem ruídos, antes feita por operações de teste e sem odor pistas de ensaios anteriores), sem um tal prática julgamento. Os animais são mantidos de acordo com as diretrizes do Comitê de Pesquisa Animal da Universidade de Kyoto.
- A sala de testes de comportamento (170 x 210 x 200 cm, Ohara & Co., Tóquio) é à prova de som e do nível de iluminação é mantida a 100 lux. Um rato é colocado na área central do labirinto com a cabeça voltada para um braço fechado. O teste de labirinto em cruz elevado é gravado com uma câmera de vídeo conectada a um computador, que é controlado por um dispositivo remoto. O número de entradas (uma entrada é definida como o centro de massa do mouse entra o braço) em cada braço e do tempo gasto nos braços abertos são gravados e estas medidas servem como um índice de ansiedade-como o comportamento.
- Os ratos são autorizados a circular livremente sobre o labirinto por 10 min. Cada rato recebe um julgamento em nossa bateria de testes. O aplicativo utilizado para a aquisição e análise de dados comportamentais (Image EP) é baseado no programa público de domínio J Imagem (desenvolvido por Wayne Rasband no Instituto Nacional de Saúde Mental e disponível em http://rsb.info.nih.gov/ ij / ), que foi modificado por Tsuyoshi Miyakawa (disponível através de O'Hara & Co., Tóquio, Japão).
- A distância percorrida, o número de entradas em cada braço, o tempo gasto em cada braço, ea porcentagem de entradas nos braços abertos são calculados pelo programa PE Image.
- Depois de cada julgamento, todas as armas e na área central são limpos com água hipocloroso super, que é um agente eficiente remoção de odor e tem odor relativamente fraco de si mesmo em comparação com outras soluções de limpeza, para evitar uma polarização com base em pistas olfactivas. Assim, podemos realizar os testes sob condições controladas sobre pistas olfativas.
Discussion
Embora o genoma do rato foi seqüenciado, as funções da maioria dos genes não são conhecidas. Técnicas de modificação genética permitem exclusão ou outra manipulação de um gene específico em camundongos (Austin et al, 2004;.. Aiba et al, 2007). A influência de um determinado gene em um comportamento específico pode ser determinada através da realização de análises comportamentais dos camundongos mutantes (Takao e Miyakawa, 2006b;. Takao et al, 2007).
O teste de labirinto em cruz elevado é um dos testes mais populares de todos os modelos animais atualmente disponíveis de ansiedade (Rodgers e Dalvi, 1997; Crawley, 2007). Este teste para a ansiedade-como o comportamento tem sido utilizado para triagem e fenotipagem transgênicos e knockout camundongos (Crawley, 1999) e para a descoberta de drogas (Hogg et al 1996;. Crawley, 2007). O teste de labirinto em cruz elevado tem uma forte validade preditiva para a triagem de drogas ansiolíticas (Rodgers e Dalvi, 1997; Mechiel Korte e De Boer, 2003; Crawley, 2007); ansiolíticos especificamente aumentar, e as drogas ansiogênicas diminuem especificamente, o número de entradas os braços abertos eo tempo gasto lá. A pontuação total de entradas e distância total são considerados um índice de atividade geral. Pontuação total de entradas é também um índice de ansiedade, e as porcentagens de entradas e tempo gasto em cada braço constituem o índice de ansiedade primária (Rodgers e Dalvi, 1997, Mechiel Korte e De Boer, 2003). Os braços abertos e fechados são considerados para evocar a mesma unidade exploratório, portanto, evitar os braços abertos é considerado como um resultado da indução de níveis mais elevados de medo (Rodgers e Dalvi, 1997). Pensa-se que a aversão de camundongos para explorar os braços abertos do labirinto é causada pelo medo de espaços abertos e elevados.
Em 1984, Handley e Mithani informou sobre os trabalhos preliminares com o teste de labirinto elevado X (plus) descrito acima. O aparelho de teste original foi elevada 70 centímetros acima do chão, e composta por dois fechados e dois braços abertos, cada um dos quais medido 45 centímetros de comprimento por 10 cm de largura. Em seus estudos iniciais, eles relataram a relação das inscrições aberto / total do braço (Handley e Mithani, 1984). Posteriormente, outros índices foram desenvolvidos, que incluiu o número de entradas nos braços fechados e abertos eo tempo gasto nos braços abertos e fechados para ratos (Pellow et al, 1985; Pellow e File, 1986) e camundongos (Lister, 1987) .
Alterações no teste de labirinto em cruz elevado incluiu alongamento de ambos os braços abertos (50 x 10 cm) e os braços fechados (50 x 10 x 40 cm) de altura com paredes em volta e um teto aberto nos braços fechados, e todo o labirinto foi elevada a uma altura de 50 cm (Pellow et al, 1985; Pellow e Arquivo, 1986). Atualmente, em nosso laboratório, o aparelho de teste de labirinto em cruz elevado é configurado na forma de um +, com dois braços abertos (25 x 5 cm, com uma muito ligeira, de 0,5 cm, parede) em frente a si e perpendiculares a dois braços fechados (25 x 5 x 16 cm), e é levantado 50 cm acima do chão (Miyakawa et al, 1996; Manabe et al, 2000; Miyakawa et al, 2001; Seeger et al, 2004; Morishima et al, 2005; Miyamoto et al, 2005; Arrow et al, 2006; Hattori et al, 2007; Niemann et al, 2007; Sano et al, 2008; Horii et al, 2008; Fukuda et al, 2008; Ikeda et al; 2008). O mouse é colocado no centro do + (5 cm x 5 cm) e é permitido explorar o labirinto livremente. Apesar de 5 min de gravação é comum, o comportamento é registrado por 10 min em nosso protocolo para aumentar a oportunidade de detectar o fenótipo. Os braços abertos e fechados elevados induzem um conflito de exploração (Mechiel Korte e De Boer, 2003; Crawley, 2007).
As medidas do teste de labirinto em cruz elevado são registrados por um observador durante o experimento. Em nosso laboratório, o teste é gravado com uma câmera de vídeo conectada a um computador e os dados comportamentais (Image EP) são adquiridos e analisados utilizando o programa PE Image. Número de entradas para os braços abertos versus número de entradas nos braços total, eo tempo gasto nos braços abertos versus braços fechados, fornecem as medidas de ansiedade-como o comportamento.
Foram avaliadas mais de 90 linhagens de ratos mutantes geneticamente modificados usando o protocolo mostrado no filme e tem um grande conjunto de dados brutos para mais de 5000 ratos (incluindo do tipo selvagem e camundongos mutantes). Em nossa bateria de testes, do tipo selvagem littermates são normalmente utilizados como controle. Como uma tensão de fundo, os camundongos C57BL/6J são amplamente utilizados. Foram coletados os dados de camundongos C57BL/6J nos testes comportamentais. Os valores obtidos de camundongos C57BL/6J em nosso teste de labirinto em cruz elevado são as seguintes (n = 914, média SEM), a distância total percorrida: 1.547,55 14,27 centímetros; duração do tempo gasto: 56,49 2,42 s (braços abertos), 384,02 3,13 s (braços fechados), 161,90 2,17 s (centro de labirinto), relação do tempo gasto nos braços abertos: 9,19% 0,36, proporção de tempo gasto nos braços fechados: 63,82 0,52%; número de entradas: 7.64 0.21 (braços abertos), 24,32 0,28 (braços fechados); entradas% aberta braço: 21,9 0,05% fechado braços entradas: 78,1 0,05. Camundongos C57BL/6J gastar menos tempo de braços abertos que nos braços fechados (p <0,0001, n = 914, T pareado test). Isto indica que os camundongos C57BL/6J tendem a evitar os braços abertos, e que o tempo gasto nos braços abertos é um índice válido de ansiedade-como o comportamento. Além disso, a ordem dos ensaios é contrabalançada em genótipos, porque o número de teste afeta o tempo gasto nos braços abertos ea plataforma central. Ou seja, os índices de todo o aumento durante o 3 º e 4 ratos em comparação com o primeiro camundongos (p = 0,0089, n = 476) (dados não publicados). Com nosso protocolo, a análise de mais de 1.661 camundongos mostraram que a ordem seqüencial dos ratos testados em uma gaiola não afeta significativamente o tempo permanecer aberto braço (dados não publicados). Ou seja, os desempenhos dos ratos primeira tirada da gaiola, não são significativamente diferentes das do segundo, o terceiro ou os ratos passado.
Embora o teste de labirinto em cruz elevado eo teste de transição claro / escuro são ambos usados para avaliar a ansiedade-como o comportamento, os resultados nem sempre são consistentes entre si (Holmes et al, 2000; Tujimura et al, 2008; Nakajima et al, no prelo ) Por exemplo, prosencéfalo específicos calcineurina knockout-ratos gastar uma diminuição da quantidade de tempo na câmara de luz no teste de transição claro / escuro, mas um aumento da quantidade de tempo nos braços abertos no teste de labirinto em cruz elevado (Miyakawa et al. , 2003). Análise fatorial da nossa bateria de testes comportamentais indica que o teste de labirinto em cruz elevado eo teste de transição claro / escuro avaliar diferentes aspectos da ansiedade-como o comportamento, como o brilhante espaço ansiedade no teste de transição claro / escuro e abrir espaço de ansiedade como comportamento no teste de campo aberto (Takao e Miyakawa, 2006b; Yamasaki et al, 2006). Assim, tanto o teste de transição claro / escuro eo teste de labirinto em cruz elevado estão incluídos na nossa bateria de testes comportamentais.
Crabbe e colegas relataram que as variáveis não controladas e experimentos caracterizando mutantes podem produzir resultados que são específicos para um laboratório particular (Crabbe et al., 1999). As diferenças que existem entre processuais laboratórios tornam difícil replicar ou comparar os resultados entre eles. Elaboração de documentação visual do protocolo irá promover uma melhor compreensão dos procedimentos experimentais, permitindo a padronização dos protocolos utilizados em laboratórios e para as comparações dos fenótipos comportamentais de várias linhagens de ratos mutantes avaliados com estes testes. Nós já publicou um protocolo de filme do teste de transição claro / escuro (Takao e Miyakawa, 2006a). Da mesma forma, os filmes de outros protocolos, como para o teste de campo aberto, o teste de natação forçada porsolt, e testes de condicionamento do medo que usamos em nossa bateria de testes comportamentais estão actualmente a ser feitos para publicação como artigos de periódicos futuro vídeo.
Disclosures
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Uso Animal e Cuidados da Universidade de Kyoto.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pela Grants-in-Aid para a Investigação Científica da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS), Grant-in-Aid do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão, Grants-in- ajuda do BIRD e do Japão CREST Ciências e Tecnologia, Grant-in-Aid da Neuroinformática Japan Center (NIJC), RIKEN e por Grant-in-Aid para a Investigação Científica da Prioridade Brain Research Areas-Integrativa (Shien) - de MEXT em Japan. Agradecemos a O'hara & Co. e Mariko Hayashi por sua assistência na criação deste filme.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Elevated plus maze | Tool | O’hara Co. | (none) |
References
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