Summary
Le test du labyrinthe surélevé est l'un des tests les plus largement utilisés pour mesurer l'anxiété comme le comportement des souris. Ici, nous présentons un film montrant les procédures détaillées pour la réalisation du test.
Abstract
Bien que le génome de la souris est maintenant complètement séquencés, les fonctions de la plupart des gènes exprimés dans le cerveau ne sont pas connus. L'influence d'un gène donné sur un comportement spécifique peut être déterminée par analyse comportementale des souris mutantes. Si un gène cible est exprimé dans le cerveau, phénotype comportemental des souris mutantes pourraient élucider le mécanisme génétique des comportements normaux. Le test du labyrinthe surélevé est l'un des tests les plus largement utilisés pour mesurer l'anxiété comme le comportement. Le test est basé sur l'aversion naturelle des souris pour les zones ouvertes et élevées, ainsi que sur leur comportement naturel exploratoires spontanées dans de nouveaux environnements. L'appareil se compose de bras à bras ouverts et fermés, traversé au milieu perpendiculairement à l'autre, et une zone centrale. Les souris sont donné accès à toutes les armes et sont autorisés à circuler librement entre eux. Le nombre d'entrées dans les bras ouverts et le temps passé dans les bras ouverts sont utilisés comme des indices d'espace ouvert anxiété induite chez la souris. Malheureusement, les différences de procédure qui existent entre les laboratoires, il est difficile de reproduire et de comparer les résultats entre les laboratoires. Ici, nous présentons un film détaillé démontrant notre protocole pour le test du labyrinthe en plus élevées. Dans notre laboratoire, nous avons évalué plus de 90 souches de souris mutantes en utilisant le protocole indiqué dans le film. Ces données seront communiquées dans le cadre d'une base de données publique que nous sommes en train de construire. Visualisation du protocole favorisera une meilleure compréhension des détails de toute la procédure expérimentale, permettant de standardisation des protocoles utilisés dans les différents laboratoires et la comparaison des phénotypes comportementaux des différentes souches de souris mutantes évaluée à l'aide de ce test.
Protocol
Protocole
- L'appareil utilisé pour le test du labyrinthe, plus élevé est dans la configuration d'un + et comprend deux bras ouverts (25 x 5 x 0,5 cm) à travers les uns des autres et perpendiculaires à deux bras fermés (25 x 5 x 16 cm) avec un centre plate-forme (5 x 5 x 0,5 cm). Les bras ouverts ont une très petite (0,5 cm) mur pour diminuer le nombre de chutes, alors que les bras fermés ont une haute (16 cm) mur pour enfermer le bras. L'ensemble du dispositif est de 50 cm au-dessus du sol (Ohara & Co., Tokyo) et est placé dans un réservoir vide circulaire (diamètre 100 cm, 35 cm de haut; normalement utilisé pour la tâche Morris labyrinthe d'eau) afin de protéger les souris qui tombent ou tentative d'évasion pendant l'expérience. L'appareil est constitué de matières plastiques. La plateforme est blanc et les murs sont transparents. Il ya une variation dans les matériaux et les couleurs de l'appareil de labyrinthe en plus élevées.
- Les souris sont logées avec une lumière de 12 h cycle jour / nuit (lumières à 07h00), comme décrit précédemment (Takao & Miyakawa, 2006a). Tests comportementaux est réalisée 09h00-18h00. Toutes les souris expérimentales sont transférés à la salle de test de comportement 30 min avant le début du premier essai à s'habituer à l'état de la salle de test de comportement. L'ordre des essais est contrebalancée dans les génotypes. Il ya deux fins de l'essai de test en utilisant un animal pratique. La première est de s'assurer que tout va bien avec le système d'enregistrement. Une autre est de maintenir l'état des tests aussi uniforme que possible. C'est, la souris toute première fois dans toute la séance d'expérience serait la condition quelque peu différent avec les autres (c'est à dire, pas de bruits avant fait par les opérations de test et aucun indice odeur de précédents essais) sans un tel essai pratique. Les animaux sont entretenus selon les directives du Comité de recherche animale de l'Université de Kyoto.
- La salle d'essai de comportement (170 x 210 x 200 cm, Ohara & Co., Tokyo) est insonorisée et le niveau d'éclairage est maintenu à 100 lux. Une souris est placée dans la zone centre du labyrinthe avec sa tête dirigé vers un bras fermés. Le test du labyrinthe surélevé est enregistrée à l'aide d'une caméra vidéo connectée à un ordinateur, qui est contrôlé par un périphérique distant. Le nombre d'entrées (une entrée est défini comme étant le centre de masse de la souris entre dans le bras) dans chaque bras et le temps passé dans les bras ouverts sont enregistrés et ces mesures servent comme un indice de l'anxiété comme le comportement.
- Les souris sont autorisés à circuler librement sur le labyrinthe pour 10 min. Chaque souris reçoit un essai dans notre batterie de tests. L'application utilisée pour l'acquisition et l'analyse des données comportementales (Image EP) est basé sur le programme J domaine de l'image publique (développé par Wayne Rasband à l'Institut national de santé mentale et disponible à http://rsb.info.nih.gov/ ij / ), qui a été modifié par Tsuyoshi Miyakawa (disponible par O'Hara & Co., Tokyo, Japon).
- La distance parcourue, le nombre d'entrées dans chaque bras, le temps passé dans chaque bras, et le pour cent d'entrées dans les bras ouverts sont calculées par le programme PE image.
- Après chaque essai, toutes les armes et la zone du centre sont nettoyés avec de l'eau hypochloreux super, qui est un agent efficace de l'odeur de déménagement et a une odeur relativement faible de lui-même par rapport à d'autres solutions de nettoyage, pour éviter un biais basée sur les signaux olfactifs. Ainsi nous pouvons effectuer les tests en condition contrôlée sur les signaux olfactifs.
Discussion
Bien que le génome de la souris a été séquencé, les fonctions de la plupart des gènes ne sont pas connus. Techniques de modification génétique permettent d'effacement ou de toute autre manipulation d'un gène spécifique chez la souris (Austin et al, 2004;.. Aiba et al, 2007). L'influence d'un gène donné sur un comportement spécifique peut alors être déterminée par des analyses comportementales des souris mutantes (Takao et Miyakawa, 2006b;. Takao et al, 2007).
Le test du labyrinthe surélevé est l'un des tests les plus populaires de tous les modèles animaux actuellement disponibles de l'anxiété (Rodgers et Dalvi, 1997; Crawley, 2007). Ce test d'anxiété comme le comportement a été utilisé pour le dépistage et le phénotypage des souris transgéniques et knock-out (Crawley, 1999) et pour la découverte de médicaments (Hogg et al 1996;. Crawley, 2007). Le test du labyrinthe surélevé a une validité prédictive forte pour le dépistage des drogues anxiolytiques (Rodgers et Dalvi, 1997; Mechiel Korte et De Boer, 2003; Crawley, 2007); anxiolytiques augmenter spécifiquement, et de médicaments anxiogènes spécifiquement baisse, le nombre d'entrées en les bras ouverts et le temps passé là-bas. Le score total des entrées et la distance totale est considérée comme un indice utile de l'activité générale. Score total des entrées est également un indice d'anxiété, et les pourcentages des entrées et le temps passé dans chaque bras constituent l'indice d'anxiété primaire (Rodgers et Dalvi 1997, Mechiel Korte et De Boer, 2003). Les bras ouverts et fermés sont considérés pour évoquer le même lecteur exploratoires, par conséquent d'éviter les bras ouverts est considéré comme un résultat de l'induction de niveaux plus élevés de la peur (Rodgers et Dalvi, 1997). On pense que l'aversion de la souris pour explorer les bras ouverts du labyrinthe est causée par la peur des espaces ouverts et surélevée.
En 1984, Handley et Mithani rapport sur les travaux préliminaires avec le test de X élevées labyrinthe (plus) décrit ci-dessus. L'appareil d'essai d'origine a été soulevée de 70 cm au-dessus du sol, et comprenait deux fermés et les deux bras ouverts, dont chacun mesure 45 cm de long par 10 cm de large. Dans leurs études initiales, ils ont signalé le rapport entre les entrées bras ouvert / total (Handley et Mithani, 1984). Par la suite, d'autres indices ont été développés qui comprenait le nombre d'entrées dans les bras fermés et ouverts et le temps passé dans les bras ouverts et fermés pour les rats (Pellow et al, 1985; Pellow et File, 1986) et la souris (Lister, 1987) .
Les modifications apportées au test du labyrinthe en plus élevés notamment l'allongement des deux les bras ouverts (50 x 10 cm) et les bras fermés (50 x 10 x 40 cm) avec de grands murs d'enceinte et un toit ouvert sur les bras fermés, et le labyrinthe a été élevé à une hauteur de 50 cm (Pellow et al, 1985; Pellow et File, 1986). Actuellement, dans notre laboratoire, les appareils de plus de élevés test du labyrinthe est configuré sous la forme d'un +, avec deux bras ouverts (25 x 5 cm, avec une très légère, de 0,5 cm, le mur) à travers les uns des autres et perpendiculaires à deux bras fermés (25 x 5 x 16 cm), et est soulevée de 50 cm au-dessus du sol (Miyakawa et al, 1996; Manabe et al, 2000; Miyakawa et al, 2001; Seeger et al, 2004; Morishima et al, 2005; Miyamoto et al, 2005; Arrow et al, 2006; Hattori et al, 2007; Niemann et al, 2007; Sano et al, 2008; Horii et al, 2008; Fukuda et al, 2008; Ikeda et al, 2008). La souris est placée dans le centre de l'+ (5 cm x 5 cm) et est autorisé à explorer le labyrinthe librement. Bien que 5 minutes d'enregistrement est commun, le comportement est enregistrée pendant 10 min dans notre protocole pour augmenter la possibilité de détecter le phénotype. Les bras ouverts et fermés élevées induisent un conflit d'exploration (Mechiel Korte et De Boer, 2003; Crawley, 2007).
Les mesures du test du labyrinthe, plus élevés sont enregistrés par un observateur lors de l'expérience. Dans notre laboratoire, le test est enregistrée avec une caméra vidéo reliée à un ordinateur et les données comportementales (Image EP) sont acquises et analysées en utilisant le programme PE image. Nombre d'entrées sur les bras ouverts par rapport au nombre d'entrées au total le bras, et le temps passé sur les bras ouverts par rapport aux bras fermés, fournissent les mesures de l'anxiété-comme le comportement.
Nous avons évalué plus de 90 souches de souris mutantes transgéniques en utilisant le protocole indiqué dans le film et ont un grand ensemble de données brutes de plus de 5000 souris (y compris de type sauvage et des souris mutantes). Dans notre batterie de tests, sœurs de type sauvage sont généralement utilisées comme contrôle. Comme une souche de fond, des souris C57BL/6J sont largement utilisés. Nous avons recueilli les données de la souris C57BL/6J dans les tests comportementaux. Les valeurs obtenues à partir des souris C57BL/6J dans notre test du labyrinthe surélevé sont les suivants (n = 914, moyenne SEM), la distance totale parcourue: 1547,55 14,27 cm; durée du temps passé: 56,49 2,42 s (bras ouverts), 384,02 3,13 s (bras fermés), 161,90 2,17 s (centre labyrinthe), ratio du temps passé dans les bras ouverts: 9,19 0,36%, le ratio du temps passé dans les bras fermés: 63.82 0.52%, le nombre d'entrées: 7,64 0,21 (bras ouverts), 24.32 0.28 (bras fermés); entrées% bras ouvert: 21,9 0,05% Fermé les entrées d'armes: 78.1 0.05. Souris C57BL/6J passer moins de temps dans les bras ouverts que dans les bras fermés (p <0,0001, n = 914, jumelé-t tHNE). Cela indique que des souris C57BL/6J ont tendance à éviter les bras ouverts, et que le temps passé dans les bras ouverts est un indice valable de l'anxiété comme le comportement. De plus, l'ordre des essais est contrebalancée travers génotypes, car le numéro d'essai influe sur le temps passé dans les bras ouverts et la plate-forme centrale. Autrement dit, les indices de toutes les augmenter au cours des 3ème et 4ème souris par rapport à la 1ère souris (p = 0,0089, n = 476) (données non publiées). Avec notre protocole, l'analyse de plus de 1661 souris ont montré que l'ordre séquentiel de la souris testées dans une cage n'affecte pas significativement le temps de séjour bras ouvert (données non publiées). Autrement dit, les performances de la souris premières mesures prises à partir de la cage ne diffèrent pas significativement de ceux de la seconde, la troisième ou la souris dernière.
Bien que le test du labyrinthe surélevé et le test de la transition jour / nuit sont tous deux utilisés pour évaluer l'anxiété comme le comportement, les résultats ne sont pas toujours compatibles entre eux (Holmes et al, 2000; Tujimura et al, 2008; Nakajima et al, sous presse ) Par exemple, prosencéphale spécifiques calcineurine-souris knockout passer une diminution de la quantité de temps dans la chambre de la lumière dans le test de la transition jour / nuit, mais une quantité accrue de temps dans les bras ouverts dans le test du labyrinthe en plus élevées (Miyakawa et al. , 2003). L'analyse factorielle de notre batterie de tests comportementaux indique que le test du labyrinthe surélevé et le test de la transition jour / nuit d'évaluer les différents aspects de l'anxiété comme le comportement, tels que l'anxiété de l'espace lumineux dans le test de transition jour / nuit et les open-space, comme l'anxiété comportement dans le test en plein champ (Takao et Miyakawa, 2006b; Yamasaki et al, 2006). En conséquence, à la fois le test de transition jour / nuit et le test du labyrinthe surélevé sont inclus dans notre batterie de tests comportementaux.
Crabbe et ses collègues ont rapporté que des variables non contrôlées et des expériences qui caractérisent les mutants peuvent donner des résultats qui sont spécifiques à un laboratoire particulier (Crabbe et coll., 1999). Les différences de procédure qui existent entre les laboratoires, il est difficile de reproduire ou de comparer les résultats entre eux. Etablir la documentation visuelle du protocole favorisera une meilleure compréhension des procédures expérimentales, permettant la normalisation des protocoles utilisés dans les laboratoires et pour la comparaison des phénotypes comportementaux des différentes souches de souris mutantes évaluée à l'aide de ces tests. Nous avions déjà publié un protocole de cinéma de l'épreuve de transition jour / nuit (Takao et Miyakawa, 2006a). De même, les films d'autres protocoles, tels que pour l'essai en plein champ, le test de natation forcée Porsolt, et des tests de conditionnement de la peur que nous utilisons dans notre batterie de tests comportementaux sont actuellement en cours pour la publication en tant que futurs articles de revue vidéo.
Disclosures
Toutes les procédures ont été approuvées par l'utilisation des animaux et du Comité des soins Université de Kyoto.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par des subventions en aide pour la recherche scientifique de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS), Grant-in-Aid du ministère de l'Education, Culture, Sports, Science et Technologie au Japon, les subventions en L'aide de BIRD et CREST du Japon science et la technologie de l'Agence, Grant-in-Aid de neuroinformatique Japan Center (NIJC), RIKEN et par Grant-in-Aid pour la recherche scientifique sur la recherche sur le cerveau domaines prioritaires-intégrative (Shien) - à partir de MEXT Japon. Nous remercions O'hara & Co. et Mariko Hayashi pour leur aide dans la création de ce film.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Elevated plus maze | Tool | O’hara Co. | (none) |
References
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