Summary
Den förhöjda plus maze test är en av de mest använda testerna för att mäta ångest-liknande beteende hos möss. Här presenterar vi en film som visar detaljerade förfaranden för utförande av testet.
Abstract
Trots att musens arvsmassa är nu helt sekvenserade, är de funktioner de flesta av de gener som uttrycks i hjärnan inte känd. Inverkan av en viss gen i en viss beteende kan bestämmas genom beteendeanalys av muterade möss. Om en målgenen uttrycks i hjärnan, kan beteendemässiga fenotyp av den muterade mössen klarlägga den genetiska mekanismen av normala beteenden. Den förhöjda plus maze test är en av de mest använda testerna för att mäta ångest-liknande beteende. Testet är baserat på naturliga motvilja hos möss för öppna och högt belägna områden, samt på deras naturliga spontana undersökande beteende i nya miljöer. Apparaten består av öppna armar och stängda armar, korsade i mitten vinkelrätt mot varandra, och ett centrum område. Möss får tillgång till alla vapen och får röra sig fritt mellan dem. Antalet inträden i öppna armar och tiden i det öppna armar används som index för öppen plats-inducerad ångest hos möss. Tyvärr processuella skillnader som finns mellan laboratorier gör det svårt att kopiera och jämföra resultat mellan laboratorier. Här presenterar vi en detaljerad film visar våra protokoll för förhöjd plus labyrint test. I vårt laboratorium har vi bedömt mer än 90 stammar av muterade möss använder protokollet som visas i filmen. Dessa data kommer att rapporteras som en del av en offentlig databas som vi nu bygger. Visualisering av protokollet kommer att främja bättre förståelse för detaljerna i hela experimentella förfarande, vilket möjliggör standardisering av de protokoll som används i olika laboratorier och jämförelser av de beteendemässiga fenotyper av olika stammar av muterade möss utvärderas med hjälp detta test.
Protocol
Protokoll
- Den apparat som används för de förhöjda plus labyrint test är i konfigurationen av ett + och består av två öppna armar (25 x 5 x 0,5 cm) mittemot varandra och vinkelräta mot två stängda armar (25 x 5 x 16 cm) med ett centrum plattform (5 x 5 x 0,5 cm). Den öppna armar har en mycket liten (0,5 cm) vägg för att minska antalet fall, medan de stängda armar har en hög (16 cm) vägg för att omsluta armen. Hela apparaten är 50 cm över golv (Ohara & Co, Tokyo) och placeras i en tom cirkulär tank (100 cm diameter, 35 cm lång, normalt används för Morris water maze uppgift) för att skydda möss som falla eller försök att fly under experimentet. Apparaten är tillverkad av plast. Plattformen är vitt och väggarna är genomskinliga. Det finns en variation i material och färger av apparaturen av förhöjt plus labyrint.
- Möss är inrymt i ett 12-h ljus / mörker-cykel (lampor på vid 7:00), som tidigare beskrivits (Takao & Miyakawa, 2006a). Behavioral tester utförs från 9:00 till 6:00. Alla experimentella möss överförs till beteendet testning rummet 30 minuter innan du påbörjar den första rättegången att vänja villkoret av beteendet testning rummet. Ordningen på försök uppvägs över genotyper. Det finns två syften med testet studie med en praxis djur. En är att se till att allt är bra med inspelningen systemet. En annan är att hålla testning skick så enhetlig som möjligt. Det vill säga, den allra första musen i hela sessionen upplever något annorlunda villkor med andra (dvs ingen tidigare ljud från testverksamhet och inga ledtrådar lukt från tidigare studier) utan att en sådan praxis rättegång. Djur är underhållits enligt riktlinjerna i djurförsök kommitté Kyoto University.
- Beteendet testning rummet (170 x 210 x 200 cm, Ohara & Co, Tokyo) är ljudisolerade och belysningen nivån bibehålls på 100 lux. En mus är placerad i mitten under labyrinten med huvudet riktat mot ett stängt arm. Den förhöjda plus maze test är inspelad med en videokamera ansluten till en dator, som kontrolleras av en fjärrenhet. Antalet poster (en post definieras som masscentrum för musen går in i armen) i varje arm och tiden i den öppna armar registreras och dessa mätningar fungera som ett index av ångest-liknande beteende.
- Möss får röra sig fritt i labyrinten i 10 min. Varje mus får en rättegång i vårt test batteri. Det program som används för att förvärva och analysera beteendemässiga data (Bild EP) är baserat på det offentliga området Image J-programmet (som utvecklats av Wayne Rasband vid National Institute of Mental Health och finns på http://rsb.info.nih.gov/ ij / ), som ändrades genom Tsuyoshi Miyakawa (tillgänglig via O'Hara & Co, Tokyo, Japan).
- Den sträcka, antalet poster i varje arm, spenderade tid i varje arm, och andelen poster i det öppna armar beräknas av Image EP-programmet.
- Efter varje försök, är alla vapen och centrum området rengöras med super hypochlorous vatten, det är ett effektivt luktborttagning agent och har relativt svag lukt av sig jämfört med andra rengöringsmedel, för att förhindra en bias baserat på lukt ledtrådar. Således kan vi utföra de tester under kontrollerade villkor om lukt ledtrådar.
Discussion
Trots att musens arvsmassa har sekvenserat, är de funktioner de flesta av de gener som inte är kända. Metoder för genetisk modifiering möjliggöra radering eller annan manipulation av en specifik gen hos möss (Austin et al, 2004;.. Aiba et al, 2007). Inverkan av en viss gen på ett visst beteende kan sedan bestämmas genom att genomföra beteendemässiga analyser av den muterade möss (Takao och Miyakawa, 2006b;. Takao et al, 2007).
Den förhöjda plus maze test är en av de mest populära tester av alla tillgängliga djurmodeller av ångest (Rodgers och Dalvi, 1997, Crawley, 2007). Detta test för ångest-liknande beteende har använts för screening och fenotypning transgena och knockout möss (Crawley, 1999) och för läkemedelsutveckling (Hogg et al 1996;. Crawley, 2007). Den förhöjda plus labyrinten test har en stark prediktiv giltighet för screening ångestdämpande läkemedel (Rodgers och Dalvi, 1997; Mechiel Korte och De Boer, 2003; Crawley, 2007), ångestdämpande läkemedel specifikt öka och ångestökande droger specifikt minska antalet poster i öppna armar och tiden där. Den sammanlagda poster poäng och totala avståndet anses vara ett användbart index allmänna verksamhet. Totalt poster poäng är också ett index på ångest och andelen poster och tid i varje arm utgör indexet av primär ångest (Rodgers och Dalvi, 1997, Mechiel Korte och De Boer, 2003). Den öppna och slutna armar anses framkalla samma undersökande enhet, därför undvikande av öppna armar anses vara en följd av induktion av högre nivåer av rädsla (Rodgers och Dalvi, 1997). Man tror att den aversion av möss att utforska öppna armar av labyrinten orsakas av rädsla för öppna och förhöjda ytor.
År 1984 rapporterade Handley och Mithani preliminära arbete med förhöjda X (plus) labyrint prov som beskrivs ovan. Den ursprungliga provningsutrustningen höjdes 70 cm över golvet, och bestod av två slutna och två öppna armar, var och en som mätte 45 cm lång och 10 cm bred. I sin första studierna rapporterades förhållandet mellan öppna / totalt armen poster (Handley och Mithani, 1984). Därefter har andra index utvecklats som ingår antalet inträden i slutna och öppna armar och tiden i slutna och öppna armar för råttor (Pellow et al, 1985; Pellow och File, 1986) och möss (Lister, 1987) .
Ändringar i förhöjda plus labyrinten testar ingår en förlängning av både öppna armar (50 x 10 cm) och slutna armar (50 x 10 x 40 cm) med höga omgivande väggar och ett öppet tak på den stängda armar, och hela labyrinten upphöjdes till en höjd av 50 cm (Pellow et al, 1985; Pellow och Arkiv, 1986). Närvarande i vårt laboratorium, är förhöjd plus labyrinten provningsutrustningen konfigurerad i form av ett +, med två öppna armar (25 x 5 cm, med en mycket liten, 0,5 cm, vägg) mittemot varandra och vinkelräta mot två stängt armar (25 x 5 x 16 cm), och höjs 50 cm över golvet (Miyakawa et al, 1996; Manabe et al, 2000; Miyakawa et al, 2001; Seeger et al, 2004; Morishima et al, 2005; Miyamoto et al, 2005; Arrow et al, 2006; Hattori et al, 2007; Niemann et al, 2007; Sano et al, 2008; Horii et al, 2008; Fukuda et al, 2008; Ikeda et al, 2008). Musen är placerad i mitten av + (5 cm x 5 cm) och får utforska en labyrint fritt. Även om 5 min inspelning är vanligt, är beteendet in i 10 min i våra protokoll för att öka möjligheten att upptäcka fenotyp. Den öppna och slutna förhöjda armar framkalla en utforskning konflikt (Mechiel Korte och De Boer, 2003; Crawley, 2007).
De åtgärder av förhöjda plus labyrinten testar registreras av en observatör under experimentet. I vårt laboratorium, är testet som spelats in med en videokamera ansluts till en dator och beteendemässiga data (Bild EP) förvärvas och analyseras med hjälp av programmet Image EP. Antalet poster på öppna armar kontra totala antalet arm poster och tid spenderas på öppna armar kontra sluten armar, ger åtgärder av ångest-liknande beteende.
Vi bedömde mer än 90 stammar av genetiskt modifierade muterade mössen använder protokollet som visas i filmen och har en stor uppsättning av rådata för mer än 5000 möss (inklusive vildtyp och muterade möss). I vårt test batteri, är vildtyp kullsyskon vanligtvis används som en kontroll. Som en bakgrund stam, är C57BL/6J möss används i stor utsträckning. Vi samlade in data för C57BL/6J möss i beteendevetenskaplig tester. De värden som erhålls från C57BL/6J möss i vårt förhöjda plus labyrint testa är följande (n = 914, medelvärde SEM), totalt tillryggalagd sträcka: 1547,55 14,27 cm, längd tillbringat tid: 56,49 2,42 s (öppna armar), 384,02 3,13 s (stängd armar), 161,90 2,17 s (labyrinten mitten), tillbringade förhållandet mellan tid i öppna armar: 9,19 0,36%, andel av tiden tillbringas i slutna famn: 63,82 0,52%, Antalet besökare: 7,64 0,21 (öppna armar) 24,32 0,28 (stängd armar),% öppet arm poster: 21,9 0,05,% stängda armar poster: 78,1 0,05. C57BL/6J möss tillbringar mindre tid i öppna armar än i slutna armar (p <0,0001, n = 914, parade t test). Detta tyder på att C57BL/6J möss tenderar att undvika öppna armar, och att tiden spenderas i öppna armar är ett giltigt index av ångest-liknande beteende. Dessutom är ordningen på försöken balanseras över genotyper, eftersom rättegången numret påverkar tiden tillbringas i öppna armar och centrum plattform. Det är, indexen alla ökningen under den 3 och 4 möss jämfört med 1: a möss (p = 0,0089, n = 476) (opublicerade data). Med våra protokoll, visade analysen av mer än 1661 möss som den sekventiella ordningen på möss testades i en bur inte nämnvärt påverkar den öppna tiden armen vistelse (opublicerade data). Det vill säga, göra föreställningar av den första möss tas från buren inte väsentligt skiljer sig från andra, tredje eller sista möss.
Även om förhöjda plus labyrint test och ljus / mörker övergången testa både används för att bedöma ångest-liknande beteende, resultaten är inte alltid konsekvent mellan dem (Holmes et al, 2000; Tujimura et al, 2008; Nakajima et al, in press ) Till exempel framhjärnan-specifika kalcineurin-knockoutmöss spendera en minskad tid i ljuset kammare i ljus / mörker övergången test, men en ökad mängd tid i öppna armar i högt plus labyrint-test (Miyakawa et al. , 2003). Faktoranalys av vårt beteende testbatteri tyder på att förhöjda plus labyrint test och ljus / mörker övergången testa bedöma olika aspekter av ångest-liknande beteende, såsom ljus och rymd ångest i ljus / mörker övergången test och öppen rymd ångest-liknande beteende i det öppna fältet testet (Takao och Miyakawa, 2006b; Yamasaki et al, 2006). Därför är både ljust / mörkt övergången test och förhöjda plus labyrinten testar ingår i vårt beteende testbatteri.
Crabbe och kollegor rapporterade att okontrollerade variabler och experiment karakteriserar mutanter kan ge resultat som är specifika för en viss laboratorium (Crabbe et al., 1999). De processuella skillnader som finns mellan laboratorier gör det svårt att replikera eller jämföra resultaten bland dem. Etablera visuell dokumentation av protokollet kommer att främja bättre förståelse för experimentella förfaranden, bedömts möjliggör standardisering av de protokoll som används över hela laboratorier och för jämförelser av beteendemässiga fenotyper av olika stammar av muterade möss med hjälp av dessa tester. Vi publicerade tidigare en film protokoll av ljus / mörker övergången test (Takao och Miyakawa, 2006a). Likaså filmer av andra protokoll, som till det öppna fältet testet, porsolt tvingades simma test, och rädsla konditionering tester som vi använder i vårt beteende testbatteri för närvarande görs för publicering som framtida artiklar video dagbok.
Disclosures
Alla förfaranden godkändes av Animal Användning och skötsel kommitté Kyoto University.
Acknowledgments
Denna forskning har finansierats med bidrag-i-Stöd för vetenskaplig forskning i Japan Society för främjande av Science (JSPS), Grant-i-Stöd från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik i Japan, Grants-i- Stöd från fågel och CREST av Japan Science and Technology Agency, Grant-i-Stöd från Neuroinformatics Japan Center (NIJC), RIKEN och Grant-i-Stöd för vetenskaplig forskning på prioriterade områden, integrativ Brain Research (Shien) - från MEXT i Japan. Vi tackar O'hara & Co och Mariko Hayashi för deras hjälp i att skapa den här filmen.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Elevated plus maze | Tool | O’hara Co. | (none) |
References
- Takao, K., Miyakawa, T. Light/dark transition test for mice. J Vis Exp. , (2006).
- Aiba, A. Mouse liaison for integrative brain research. Neurosci Res. 58, 103-104 (2007).
- The knockout mouse project. Nat Genet. 36, 921-924 (2004).
- Takao, K., Miyakawa, T. Investigating gene-to-behavior pathways in psychiatric disorders: the use of a comprehensive behavioral test battery on genetically engineered mice. Ann N Y Acad Sci. 1086, 144-159 (2006).
- Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Impact of brain-behavior phenotyping of genetically-engineered mice on research of neuropsychiatric disorders. Neurosci Res. 58, 124-1232 (2007).
- Crawley, J. N. What's Wrong With My Mouse? Behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , 2nd edition, John Wiley and Sons. New York. 240 (2007).
- Rodgers, R. J., Dalvi, A. Anxiety, defense and the elevated plus-maze. Neurosci Behav Rev. 21, 801-810 (1997).
- Handley, S. L., Mithani, S. Effects of alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze-exploration model of 'fear'-motivated behaviour. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 324, 1-5 (1984).
- Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. J Neurosci Meth. 14, 149-167 (1985).
- File, S. E., Pellow, S. The effects of triazolobenzodiazepines in two animal tests of anxiety and in the holeboard. Br J Pharmac. 86, 729-7235 (1985).
- Lister, R. G. The use of a plus-maze to measure anxiety in the mouse. Psychopharmacology. 92, 180-185 (1987).
- Miyakawa, T., Yagi, T., Kagiyama, A., Niki, H. Radial maze performance, open-field and elevated plus-maze behaviors in Fyn-kinase deficient mice: further evidence for increased fearfulness. Brain Res Mol Brain Res. 37, 145-150 (1996).
- Manabe, T. Loss of cadherin-11 adhesion receptor enhances plastic changes in hippocampal synapses and modifies behavioral responses. Mol Cell Neurosci. 15, 534-546 (2000).
- Miyakawa, T., Yamada, M., Duttaroy, A., Wess, J. Hyperactivity and intact hippocampus-dependent learning in mice lacking the M1 muscarinic acetylcholine receptor. J Neurosci. 21, 5239-5250 (2001).
- Seeger, T. M2 muscarinic acetylcholine receptor knockout mice show deficits in behavioral flexibility, working memory, and hippocampal plasticity. J Neurosci. 24, 10117-10127 (2004).
- Morishima, Y. Enhanced cocaine responsiveness and impaired motor coordination in metabotropic glutamate receptor subtype 2 knockout mice. Proc Natl Acad Sci USA. 102, 4170 (2005).
- Miyamoto, T. Tight junctions in Schwann cells of peripheral myelinated axons: a lesson from claudin-19-deficient mice. J Cell Biol. 169, 527-538 (2005).
- NFAT dysregulation by increased dosage of DSCR1 and DYRK1A on chromosome 21. Nature. 441, 595-600 (2006).
- Hattori, S. Enriched environments influence depression-related behavior in adult mice and the survival of newborn cells in their hippocampi. Behav Brain Res. 180, 69-76 (2007).
- Niemann, S. Genetic ablation of NMDA receptor subunit NR3B in mouse reveals motoneuronal and non-motoneuronal phenotypes. Europ J Neurosci. 26, 1407-1420 (2007).
- Sano, H., Nagai, Y., Miyakawa, T., Shigemoto, R., Yokoi, M. Increased social interaction in mice deficient of the striatal medium spiny neuron-specific phosphodiesterase 10A2. J Neurochem. 105, 546-556 (2008).
- Horii, Y., Yamasaki, N., Miyakawa, T., Shiosaki, S. Increased anxiety-like behavior in neuropsin (kallikrein-related peptidase 8) gene-deficient mice. Behav Neurosci. 122, 498-504 (2008).
- Fukuda, E. Down-regulation of protocadherin-α, A isoforms in mice changes contextual fear conditioning and spatial working memory. Eur J Neurosci. , In Press Forthcoming.
- Ikeda, M. Identification of YWHAE, a gene encoding 14-3-3epsilon, as a possible susceptibility gene for schizophrenia. Behav Neurosci. , In Press Forthcoming.
- Korte, S. M., De Boer, S. F. A robust animal model of state anxiety: fear-potentiated behaviour in the elevated plus-maze. Eur J Phamacol. 463, 163-175 (2003).
- Hogg, S. A review of the validity and variability of the elevated plus-maze as an animal model of anxiety. Pharmacol Biochem Behav. 54, 21-30 (1996).
- Holmes, A., Parmigiani, S., Ferrari, P. F., Palanza, P., Rodgers, R. J. Behavioral profile of wild mice in the elevated plus-maze test for anxiety. Physiol Behav. 71, 509-516 (2000).
- Tsujimura, A., Matsuki, M., Takao, K., Yamanishi, K., Miyakawa, T., Hashimoto-Gotoh, T. Mice lacking the kf-1 gene exhibit increased anxiety- but not despair-like behavior. Front. Behav. Neurosci. 10, In Press (2008).
- Nakajima, R., Takao, K., SM, H. uang, Takano, J., Iwata, N., Miyakawa, T., Saido, T. C. Comprehensive Behavioral Phenotyping of Calpastatin-Knockout Mice. Molecular Brain. , In Press Forthcoming.
- Miyakawa, T. Conditional calcineurin knockout mice exhibit multiple abnormal behaviors related to schizophrenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 8987-8992 (2003).
- Factor analyses of large-scale data justify the behavioral test battery strategy to reveal the functional significances of the genes expressed in the brain. Yamasaki, N. The 36th Annual Meeting of the Society for Neuroscience, 2006 October 14–18, Atlanta, Georgia, , Program number 100.15, Poster Number PP32 (1985).
- Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. Genetics of mouse behavior: interactions with laboratory environment. Scienc. 284, 1670-1672 (1999).
