Summary
Геном вируса гриппа А состоит из восьми отдельных комплексов РНК и белков, называемых вирусными комплексов рибонуклеопротеидных (vRNPs). Эта статья описывает очистки глицерина градиента и просвечивающей электронной микроскопии визуализации гриппа vRNPs.
Abstract
Гриппа, вирусного генома состоит из восьми отрицательного смысла, одноцепочечной молекулы РНК, в индивидуальной упаковке с несколькими копиями гриппа нуклеопротеида (НП) в вирусные частицы ribonulceoprotein (vRNPs). Гриппа vRNPs заключены внутри вирусной оболочки. Во время ввода данных в ячейку, однако, эти vRNP комплексов высвобождаются в цитоплазму, где они получают доступ к хост ядерное движение машин. С целью изучения ядерного импорта гриппа vRNPs и репликации генома гриппа, это полезно для работы с изолированными vRNPs так, чтобы другие компоненты вируса не вмешиваются в эти процессы. Здесь мы опишем процедуру, чтобы очистить эти vRNPs от гриппа вирус. Процедура начинается с нарушения гриппа вириона с моющими средствами для того, чтобы выпустить vRNP комплексов из окутан вириона. VRNPs затем отделить от других компонентов вириона гриппа на 33-70% разрывной градиент глицерина по скорости осадконакопления. Фракции, полученные из глицерина градиент которые затем анализируются с помощью на SDS-PAGE после окрашивания Кумасси синий. Пик фракций, содержащих НП затем объединяются и концентрированной с помощью центрифугирования. После концентрации, целостность vRNPs проверяется визуализации vRNPs методом просвечивающей электронной микроскопии после отрицательного окрашивания. Очистки глицерина градиент изменения, что с Кемлера
Protocol
Часть 1: Разрушение гриппа Вирион
- Добавить 750 мкл буфера тугриков (20 мМ MES, 150 мМ NaCl, 30 мМ Трис, рН 7,5) в одну Бекман поликарбоната центрифуге трубки (11 мм х 34 мм) рассчитана на установку в TLA-120,2 ротора для использования в Бекман Оптима Max-E ультрацентрифуге.
- Добавить 500 мкл вируса гриппа А (H3N2 Х-31 A/AICHI/68 штамма; 2 мг / мл) в эту трубу. Смешайте вируса с МНТ буфера с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.
- Центрифуга течение 10 минут при 109 000 мкг, 4 ° С, в Бекман Optima Max-E центрифуги использованием TLA-120,2 ротора.
- Удалить супернатант, и ресуспендируют осадок в 500 мкл буфера нарушения (100 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2, 5% (вес / объем) глицерин, 50 мМ octylglucoside, 10 мг / мл лизолецитин, 1,5 мМ дитиотреитол, 100 мМ MES, рН 5,5).
- Vortex энергично, а затем встряхнуть при 31 ° С в течение 20 минут в Эппендорф thermomixer.
Часть 2: Глицерин градиента скорости центрифугирования осадка
- Подготовка глицерина градиент, поставив следующие количества глицерина в центрифуге Beckman ultraclear трубки (13 мм х 51 мм): 1 мл 70% (объем / объем) глицерин, 0,75 мл 50% глицерин, 0,375 мл 40% глицерина и 1,8 мл 33% глицерина. Глицерин решения принимаются путем смешивания чистого глицерина с Н. М. буфера (150 мМ NaCl, 50 мМ MES, рН 5,5). Также подготовить баланс трубки, содержащие как глицерин и буфера.
- Vortex нарушена вирусного образца снова, и загрузить его на глицерин градиента.
- Центрифуга градиент 3,75 часа при 217 000 мкг, 4 ° С, в Бекман MLS-50-размахивая ведром ротора.
- После центрифугирования завершения вручную собирать 250 мкл аликвоты градиента, начиная с верхней части трубки. Держите фракций на льду или при температуре 4 ° C.
Часть 3: Анализ фракций Глицерин Градиент по SDS электрофореза в полиакриламидном геле
- Удалить из 20 мкл каждой фракции в новую пробирку.
- Добавьте 5 мкл 5x SDS-PAGE образца буфера.
- Нагреть до 95 ° С в течение 5 минут.
- Спином вниз образцы кратко и загружать их на 10% полиакриламидном геле, и включают маркеры молекулярного веса в одной из скважин.
- Выполнить образцов на гель, пока бромфенол синего красителя загрузки достигает близко к нижней части геля.
- Пятно гель Кумасси синий.
Часть 4: Концентрация vRNP Фракции
- Выберите глицерин фракций, содержащих главным образом Н.П., объединить их и распределить их на две Бекман поликарбоната центрифужные пробирки (11 мм х 34 мм).
- Заполните каждую пробирку с диэтиловым pyrocarbonate (DEPC) обработанных сверхчистой воды и пипеткой вверх и вниз несколько раз перемешать.
- Центрифуга в течение 4,5 часа при 157 000 мкг, 4 ° С, в Бекман TLA-120,2 ротора.
- Удалить супернатант, и ресуспендируют осадок в 50 мкл DEPC обработанной воды.
- При желании, 280 из концентрированного vRNPs может быть измерена. Как NP является основным компонентом в настоящее объединенных фракций, оценку молярность НП может быть рассчитана по его коэффициент экстинкции 55350 М -1 см -1 (как это определено через ProtParam 3).
- Алиготе очищенной vRNPs, и хранить их замораживали при -80 ° C для дальнейшего использования.
Часть 5: Отрицательные Окрашивание vRNPs
- Развести 1 мкл очищенной vRNP на 9 мкл свежей производства и фильтруется-два раза МНТ буфера (20 мМ MES, 150 мМ NaCl, 30 мМ Трис, рН 7,5). Другие буферы и OK, чтобы разбавить vRNPs и мыть образца сетки (шаг 5.5), но не использовать PBS если уранилацетата используется для отрицательной окраски.
- Тлеющего разряда образца (медь ПЭМ) сетки ранее окрашенных parlodion и углеродной пленки в течение 30 секунд.
- Держите свеже тлеющем выписан образца сетки с помощью пинцета, а также применять 5-мкл каплю разбавленного vRNP на образец сетки.
- Оставьте капли образца на сетке в течение 8 минут.
- Во время ожидания, места небольшую полоску парафильмом на скамейке, и обойтись 2 капли, содержащие 10 мкл буфера МНТ (мыть сетку), и 80-мкл капли свежеприготовленного красящим раствором (1% молибдата аммония или 1 % уранилацетата) на парафильмом.
- После 8-минут адсорбции, фитиль от части образца раствора из образца сетки с кусочек фильтровальной бумаги (разрезанных на треугольники). Не позволяйте образца сетки для просушки.
- Промыть образец сетки в 2 капли, содержащие 10 мкл буфера для MNT общее время 1 минута. Это можно сделать, внимательно снижение образца сетки на падение, а затем влагу от части образца раствора из образца сетку с куском фильтровальной бумаге (не давая образец сетки сухой).
- Сразу же после влагу от последней капли буфера от образца сетки, в комплектеLy погрузить образец сетки в пределах пятна капель и подождите 1 минуту.
- Полностью фитиль от окраски раствора от образца сетку с куском фильтровальной бумаги.
- Разрешить образца сетке высохнуть на воздухе в течение нескольких минут до наблюдения в электронном микроскопе.
Часть 6: Представитель Результаты:
Рисунок 1
Как гриппа Н.П. (~ 56 кДа) является основной белок, содержащийся в вирусную комплексов рибонуклеопротеидных, группа НП как правило, сильные группы в фракций, содержащих vRNPs (рис. 1). В дополнение к Н. П., каждый гриппа vRNP также содержит копию тримерной РНК-полимеразы (молекулярный вес 82, 86 и 86,5 кДа) комплекса. Они могут быть или не быть видимым окрашиванием Кумасси синим, потому что их обилие низка по сравнению с NP. Полимераз, однако, может быть обнаружен, если вместо Commassie синевы, серебряные пятна гель не выполняется. Гриппа матрица белка М1 (~ 28 кДа) должны быть минимально присутствует в фракций, где Н. П. белковых фракций пика присутствуют.
Рисунок 2
Негативно окрашенные vRNPs как визуализируются при электронной микроскопии должно дать vRNPs, которые напоминают палочковидные частицы с переменной длины, примерно 30 нм до 120 нм в длину (рис. 2а). Олигомерные NP организован как цепочка NP молекулы, которые в дальнейшем сложенными в двойную спиральную структуру повторить, так как петли на концах этих палочковидные частицы иногда можно увидеть (рис. 2б).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Очистка vRNPs основана на методике, описанной Кемлера и соавт. (1994) 1. Мы и другие также используют этот протокол для изоляции vRNPs для изучения их ядерных импорта. 2,4,5
Мы рекомендуем использовать РНКазы-бесплатные советы и трубки при манипулировании vRNPs потому что вирусный геном состоит из РНК и, следовательно, ухудшает легко в присутствии РНК. Кроме того, все буферы должны быть сделаны в воде, которая РНКазы бесплатно. Протокол, описанный здесь, был проведен с кислой добычи (например, рН буфера разрушения и глицерина градиент 5,5). Кроме того, основной добычей могут быть выполнены (как описано Кемлера и соавт. (1994) 1), подставляя MES, рН 5,5 с Трис, рН 7,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от Канады Фонд инноваций (CFI), Канадский институт исследований в области здравоохранения (CIHR), и естественным наукам и инженерным исследованиям Совета Канады (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A | Charles River Laboratories | 490715 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M-8250 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-1 | |
| Octylglucoside | Sigma-Aldrich | O-8001 | |
| Lysolecithin | Sigma-Aldrich | L-4129 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D-9779 | |
| Coomassie brilliant blue G-250 | Kodak | 1367796 | |
| diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water | Invitrogen | 750024 | |
| Uranyl Acetate | Ted Pella, Inc. | 19481 | |
| Ammonium Molybdate | Fisher Scientific | A-674 | |
| Optima MAX-E Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 434491 | |
| MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket | Beckman Coulter Inc. | 367280 | |
| TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium | Beckman Coulter Inc. | 362046 | |
| Eppendorf Thermomixer | Lauda Brinkmann | 022670000 |
References
- Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins. Virology. 202, 1028-1033 (1994).
- Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes. J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).
- Gasteiger, E. The Proteomics Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).
- Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Panté, Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein. Virol J. 4, 49-49 (2007).
- Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes. Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).
