Summary
הגנום של שפעת וירוס כוללת שמונה מתחמים נפרדים של רנ"א וחלבונים, כינה מתחמי ribonucleoprotein ויראלי (vRNPs). מאמר זה מתאר את שיפוע גליצרול טיהור במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים להדמיה של שפעת vRNPs.
Abstract
שפעת A הגנום הנגיפי מורכב תחושה שלילית ושמונה, יחיד מולקולות RNA תקועים, ארוזים בנפרד עם מספר עותקים של שפעת nucleoprotein (NP) לחלקיקים ribonulceoprotein ויראלי (vRNPs). VRNPs שפעת מוקפים בתוך מעטפת נגיפיים. במהלך כניסה לתא, לעומת זאת, קומפלקסים אלה vRNP משתחררים לתוך הציטופלסמה, שם הם לקבל גישה מכונות התחבורה גרעיני המארח. על מנת ללמוד את הייבוא הגרעין של vRNPs שפעת שכפול של הגנום שפעת, כדאי לעבוד עם vRNPs מבודד כך רכיבים אחרים של הנגיף לא להפריע לתהליכים אלה. כאן אנו מתארים הליך לטהר אלה vRNPs משפעת וירוס. ההליך מתחיל עם הפרעה של שפעת virion עם דטרגנטים על מנת לשחרר את מתחמי vRNP מ virion אפף. VRNPs מופרדים אז מן המרכיבים האחרים של שפעת virion על שיפוע 33-70% גליצרול רציפה על ידי שקיעה מהירות. שברים המתקבל השיפוע גליצרול מנותחים לאחר מכן צביעה עם Coomassie כחול על דרך עמוד SDS. שברים השיא המכיל NP אז הם אספו יחד מרוכז על ידי צנטריפוגה. לאחר ריכוז, שלמות vRNPs הוא מאומת על ידי הדמיה של vRNPs ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים לאחר מכתים שלילי. טיהור הדרגתי גליצרול הוא שינוי כי מן קמלר
Protocol
חלק 1: שיבוש של שפעת Virion
- הוסף 750 μl של חיץ MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 מ"מ טריס, pH 7.5) לתוך הגליל האחד פוליקרבונט צנטריפוגות Beckman (11 מ"מ x 34 מ"מ) נועדה להשתלב הרוטור TLA-120.2 לשימוש אופטימה Beckman Max-E ultracentrifuge.
- הוסף 500 μl של שפעת וירוס (H3N2 X-31 A/AICHI/68 זן, 2 מ"ג / מ"ל) לתוך הצינור. מערבבים את הנגיף עם למאגר MNT ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים.
- צנטריפוגה במשך 10 דקות על 109,000 XG, 4 ° C, צנטריפוגה אופטימה Max-E Beckman באמצעות הרוטור TLA-120.2.
- הסר את supernatant ו resuspend גלולה במאגר 500 שיבוש μl (100 מ"מ KCl, 5 מ"מ MgCl 2, 5% (w / v) גליצרול, octylglucoside 50 מ"מ, 10 מ"ג / מ"ל lysolecithin, dithiothreitol 1.5 מ"מ, 100 מ"מ MES, pH 5.5).
- וורטקס במרץ, ולאחר מכן ללחוץ על 31 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות thermomixer Eppendorf.
חלק 2: צבע גליצרול משקעים צנטריפוגה מהירות
- הכן שיפוע גליצרול על ידי הצבת את הסכומים הבאים של גליצרול לתוך צינור Beckman צנטריפוגות ultraclear (13 מ"מ x 51 מ"מ): 1 מ"ל 70% (v / v) גליצרול, 0.75 מ"ל גליצרול 50%, 0.375 מ"ל גליצרול 40%, ו - 1.8 מ"ל 33% גליצרול. פתרונות גליצרול מבוצעים על ידי ערבוב גליצרול טהור עם חיץ NM (150 mM NaCl, 50 מ"מ MES, pH 5.5). כמו כן להכין צינור המכיל איזון גם גליצרול חיץ.
- וורטקס שיבשו מדגם ויראלי שוב, לטעון אותו על השיפוע גליצרול.
- צנטריפוגה שיפוע עבור 3.75 שעות 217.000 XG, 4 ° C, רוטור MLS-50-Beckman מתנדנד דלי.
- לאחר צנטריפוגה תושלם, ידני לאסוף 250 aliquots μl של שיפוע החל מהחלק העליון של הצינור. שמור שברים על הקרח או 4 ° C.
חלק 3: ניתוח של שברים Gradient גליצרול על ידי ג'ל אלקטרופורזה SDS polyacrylamide
- הסר 20 μl כל חלק מן לצינור טריים.
- הוסף 5 μl של חיץ SDS-PAGE 5x המדגם.
- מחממים עד 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- ספין את דגימות בקצרה ומעלים אותם על ג'ל polyacrylamide 10%, והם כוללים סמנים משקל מולקולרי באחת הבארות.
- הפעל את הדגימות על הג'ל עד לצבוע bromphenol טעינת כחול מגיע קרוב לתחתית הג'ל.
- הכתם ג'ל עם Coomassie כחול.
חלק 4: ריכוז של שברים vRNP
- בחר את השברים גליצרול המכיל בעיקר NP, לשלב אותם, ולהפיץ אותם לשתי מבחנות צנטריפוגה Beckman פוליקרבונט (11 מ"מ x 34 מ"מ).
- ממלאים כל צינור עם diethyl pyrocarbonate (DEPC) שטופלו מים ultrapure ו pipet מעלה ומטה מספר פעמים כדי לערבב.
- צנטריפוגה עבור 4.5 שעות ב 157,000 XG, 4 ° C, רוטור TLA-120.2 Beckman.
- הסר את supernatant ו resuspend את הכדור ב 50 μl מים DEPC שטופלו.
- אם תרצה, 280 של vRNPs מרוכז ניתן למדוד. כפי NP היא כיום מרכיב מרכזי אספו את השברים, אומדן molarity של NP יכול להיות מחושב באמצעות מקדם הכחדה של 55,350 M -1 cm -1 (כפי שנקבע באמצעות ProtParam 3).
- Aliquot vRNPs מטוהרים, ולאחסן אותם קפואים ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר.
חלק 5: מכתים שלילי של vRNPs
- מדולל 1 μl של vRNP מטוהרים לתוך μl 9 של טרי מתוצרת מסונן, פעמיים חיץ MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 מ"מ טריס, pH 7.5). מאגרים נוספים הם גם אישור כדי לדלל את vRNPs כדי לשטוף את הרשת הדגימה (שלב 5.5), אבל לא להשתמש PBS אם אצטט uranyl משמש מכתים שלילי.
- זוהר פריקה טיפוס (TEM נחושת) מצופה בעבר עם parlodion הסרט פחמן למשך 30 שניות רשת.
- החזק את רשת טרי זוהר משוחררים הדגימה עם פינצטה, ולהחיל על ירידה של 5 μl של vRNP מדולל על הרשת הדגימה.
- להשאיר את טיפה של הדגימה על רשת במשך 8 דקות.
- בזמן ההמתנה, במקום רצועה קטנה של Parafilm על הספסל, ולחלק 2 טיפות המכילות 10 μl כל חיץ MNT (כדי לשטוף את הרשת), וירידה של 80 μl של הפתרון מכתים טריים (1% אמוניום molybdate או 1 uranyl אצטט%) על Parafilm.
- לאחר 8 דקות של ספיחה, הפתיל את חלק מהפתרון מדגם מרשת הדגימה עם פיסת נייר סינון (לחתוך למשולשים). אל תתנו את רשת הדגימה לייבוש.
- לשטוף רשת הדגימה ב 2 טיפות המכילות 10 μl כל חיץ MNT זמן הכולל של דקה 1. הדבר נעשה על ידי הורדת בזהירות את הרשת הדגימה על ירידה, ולאחר מכן את הפתילה חלק מהפתרון מדגם מרשת הדגימה עם פיסת נייר סינון (בלי לתת את הרשת הדגימה יבש).
- מיד לאחר הפתילה את הטיפה האחרונה של חיץ מרשת הדגימה, להשליםלצלול ly רשת הדגימה בתוך טיפה את הכתם ולהמתין 1 דקה.
- הפתיל לחלוטין את פתרון הכתם מן הרשת את הדגימה עם פיסת נייר הסינון.
- לאפשר את רשת הדגימה לאוויר יבש במשך כמה דקות לפני תצפית במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.
חלק 6: תוצאות נציג:
איור 1
כמו שפעת A NP (~ 56 KDA) הוא החלבון העיקרי המצוי מתחמי ribonucleoprotein ויראלי, הלהקה NP בדרך כלל היא הלהקה החזקה ביותר שברים המכיל את vRNPs (איור 1). בנוסף NP, כל vRNP שפעת מכיל גם עותק של פולימראז RNA מורכב trimeric (משקולות מולקולרית של kDa 82, 86 ו - 86.5). אלה עשויה או לא עשויה להיות גלוי על ידי מכתים כחול Coomassie בגלל השפע שלהם הוא נמוך בהשוואה לזה של NP. Polymerases, לעומת זאת, ניתן להבחין אם, במקום כחול Commassie כתם, כסף כתם של הג'ל מתבצעת. מטריקס שפעת חלבון M1 (~ 28 KDA) צריכים להיות נוכחים מינימלית של שברים שבו שיא חלבון שברים NP נוכחים.
איור 2
VRNPs שלילי מוכתם כמו דמיינו תחת מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים אמור להניב vRNPs הדומות מוט בצורת חלקיקים בעלי אורך משתנה, כי הם כ -30 ננומטר עד 120 ננומטר אורך (איור 2 א). NP oligomeric מאורגן כמו שרשרת של מולקולות NP כי הוא מקופל נוספת לתוך מבנה הסליל הכפול לחזור, אז לולאות משני קצותיו של מוט אלה חלקיקים דמויי לפעמים ניתן לראות (איור 2b).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טיהור vRNPs מבוסס על ההליך המתואר על ידי קמלר et al. (1994). 1 אנו ואחרים משמשים גם בפרוטוקול זה על מנת לבודד vRNPs ללמוד לייבא הגרעין שלהם. 2,4,5
אנו ממליצים להשתמש RNase ללא טיפים וצינורות כאשר מניפולציה vRNPs כי הגנום הנגיפי מורכב של רנ"א, ולכן הנשחק בקלות בנוכחות RNA. בנוסף, חוצצי כל צריך להיעשות במים כי הוא RNase חינם. הפרוטוקול המתואר כאן בוצע מיצוי חומצי (למשל, ה-pH של למאגר שיבוש ואת שיפוע גליצרול הוא 5.5). כמו כן, עקירת בסיסי יכול להתבצע (כפי שתואר על ידי קמלר et al. (1994) 1) על ידי החלפת MES, pH 5.5 עם טריס, pH 7.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן קנדה עבור חדשנות (CFI), המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR), ואת למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A | Charles River Laboratories | 490715 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M-8250 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-1 | |
| Octylglucoside | Sigma-Aldrich | O-8001 | |
| Lysolecithin | Sigma-Aldrich | L-4129 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D-9779 | |
| Coomassie brilliant blue G-250 | Kodak | 1367796 | |
| diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water | Invitrogen | 750024 | |
| Uranyl Acetate | Ted Pella, Inc. | 19481 | |
| Ammonium Molybdate | Fisher Scientific | A-674 | |
| Optima MAX-E Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 434491 | |
| MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket | Beckman Coulter Inc. | 367280 | |
| TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium | Beckman Coulter Inc. | 362046 | |
| Eppendorf Thermomixer | Lauda Brinkmann | 022670000 |
References
- Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins. Virology. 202, 1028-1033 (1994).
- Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes. J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).
- Gasteiger, E. The Proteomics Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).
- Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Panté, Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein. Virol J. 4, 49-49 (2007).
- Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes. Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).
