A型流感病毒的基因组由8个独立的复合物,RNA和蛋白质,称为病毒核蛋白复合物(vRNPs)。本文介绍的甘油梯度纯化和透射电子显微镜A型流感vRNPs可视化。
A型流感病毒的基因组由8负意义上说,单链RNA分子单独包装,与A型流感到的病毒ribonulceoprotein颗粒(vRNPs)核蛋白(NP)的多个副本。流感vRNPs封闭的病毒包膜内。然而,在进入细胞,这些vRNP复合物释放到细胞质,在那里他们获得主机核运输机械。为了研究核进口的流感vRNPs和流感基因组复制的,它与孤立的vRNPs工作,使病毒的其他组件不干扰这些进程是有益的。在这里,我们描述一个过程来净化这些vRNPs从A型流感病毒。程序启动以释放笼罩病毒粒子vRNP复合物,用清洁剂A型流感病毒粒子的干扰。 vRNPs是从A型流感病毒粒子在33-70%的速度沉淀间断甘油梯度的其他部分隔开。从甘油梯度获得的分数,然后通过SDS – PAGE电泳分析,考马斯亮蓝染色后。包含NP峰值分数,然后汇集在一起,并通过离心浓缩。浓度后,vRNPs的完整性是通过可视化的传输电子显微镜负染色后的vRNPs验证。甘油梯度纯化的修改,从Kemler<em>等。</em>(1994)<sup> 1</sup>和负染色进行吴<em>等。</em>(2007年)。<sup> 2</sup
vRNPs净化Kemler 等人 (1994年)所描述的程序的基础上,我们和其他人也用此协议隔离vRNPs,研究它们的核进口。2,4,5
我们建议使用无RNase的技巧和操纵vRNPs管时,因为病毒基因组RNA的组成,因此很容易降解的RNA的存在。此外,所有的缓冲区,应即核糖核酸免费的水。这里所描述的协议,是一种酸性提取(如中断缓冲区和甘油梯度的pH值是5.5)。同样,一个基本的?…
这项工作是由加拿大创新基金会(CFI),加拿大卫生研究所(CIHR)学院,以及自然科学与工程研究理事会(NSERC),加拿大的赠款支持。