Biology

A型流感病毒的核蛋白复合物的分离纯化及可视化

Published: February 9, 2009 doi: 10.3791/1105

Winco W.H. Wu¹, Lindsay L. Weaver¹, Nelly Panté¹

¹Department of Zoology, University of British Columbia - UBC

Summary

A型流感病毒的基因组由8个独立的复合物，RNA和蛋白质，称为病毒核蛋白复合物（vRNPs）。本文介绍的甘油梯度纯化和透射电子显微镜A型流感vRNPs可视化。

Abstract

A型流感病毒的基因组由8负意义上说，单链RNA分子单独包装，与A型流感到的病毒ribonulceoprotein颗粒（vRNPs）核蛋白（NP）的多个副本。流感vRNPs封闭的病毒包膜内。然而，在进入细胞，这些vRNP复合物释放到细胞质，在那里他们获得主机核运输机械。为了研究核进口的流感vRNPs和流感基因组复制的，它与孤立的vRNPs工作，使病毒的其他组件不干扰这些进程是有益的。在这里，我们描述一个过程来净化这些vRNPs从A型流感病毒。程序启动以释放笼罩病毒粒子vRNP复合物，用清洁剂A型流感病毒粒子的干扰。 vRNPs是从A型流感病毒粒子在33-70％的速度沉淀间断甘油梯度的其他部分隔开。从甘油梯度获得的分数，然后通过SDS - PAGE电泳分析，考马斯亮蓝染色后。包含NP峰值分数，然后汇集在一起，并通过离心浓缩。浓度后，vRNPs的完整性是通过可视化的传输电子显微镜负染色后的vRNPs验证。甘油梯度纯化的修改，从Kemler

Protocol

第1部分：中断一个流感病毒粒子

添加到一个贝克曼聚碳酸酯离心管，设计成TLA - 120.2转子适合在贝克曼的Optima使用（11毫米× 34毫米）的750名产妇和新生儿破伤风缓冲液（MES的20毫米，150毫米氯化钠，30毫米的Tris，pH值7.5）马克斯 - E超速离心机。
添加到该管的A型流感病毒（H3N2型X - 31 A/AICHI/68应变; 2毫克/毫升）500μL。移液器向上和向下几次与产妇和新生儿破伤风的缓冲区混合病毒。
109000 XG，4 ° C离心10分钟，在一个贝克曼舰最大- E使用TLA - 120.2转子离心机。
去除上清，重新悬浮颗粒在500μL中断缓冲区（100毫米氯化钾，氯化镁₂ 5毫米，5％（W / V）甘油，50毫米octylglucoside，10毫克/毫升溶血卵磷脂，二硫苏糖醇1.5毫米，100毫米的MES， pH值5.5）。
涡大力，然后摇在31℃20分钟在一个小指thermomixer彗星。

第2部分：甘油梯度泥沙速度离心

准备放入一个贝克曼ultraclear离心管（13毫米× 51毫米）以下的甘油，甘油梯度：1毫升70％（V / V）甘油，0.75毫升50％甘油，0.375毫升40％甘油，和1.8毫升33％甘油。甘油的解决方案是由纯甘油的混合纳米缓冲区（MES，pH值5.5，50毫米150毫米氯化钠）。还准备同时含有甘油和缓冲的平衡管。
旋涡再次扰乱了病毒样本，并加载到甘油梯度。
离心机梯度为3.75小时，217000 XG 4 ° C，在一个贝克曼MLS - 50斗摆动转子。
离心完成后，手动收集250μL等份，从管的顶部开始梯度。保持在冰上或在4 ° C的分数

第3部分：通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的甘油梯度分数

从每个几分新鲜管取出20μL。
新增5 5倍的SDS - PAGE样品缓冲液。
加热至95 ° C 5分钟。
简要离心样品，并加载到10％的聚丙烯酰胺凝胶，分子量标记，其中包括在井之一。
凝胶上运行的样本，直到溴酚蓝上样染料达到接近凝胶底部。
考马斯蓝染色的凝胶。

第4部分：vRNP分数的浓度

选择含有主要NP甘油分数，将它们结合起来，和他们分配到两个贝克曼聚碳酸酯离心管（11毫米× 34毫米）。
焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的超纯水，和吸管起来，几次下来混合填充每个管。
157000 XG，4 ° C离心4.5小时，在一个贝克曼TLA - 120.2转子。
去除上清液，并在50μLDEPC处理过的水重新悬浮沉淀。
如果需要，集中vRNPs ₂₈₀可以衡量的。为NP是汇集分数的重要组成部分目前，估计的NP摩尔可以^使用 M -1 ^厘米 -1（通过^ProtParam 3确定）的55350消光系数计算。
vRNPs纯化，分装和存储他们冻结在-80 ° C为以后使用。

第5部分：vRNPs负染

到9μL稀释1μL纯化vRNP新鲜和过滤两次产妇和新生儿破伤风的缓冲区（三30毫米，20毫米的MES，150 mM氯化钠，pH值7.5）。其他缓冲区也确定淡化vRNPs洗试样的网格（步骤5.5），但如果不使用PBS醋酸铀负染。
辉光放电的标本（铜透射电镜）电网之前30秒一个parlodion和碳薄膜的涂层。
保持与镊子新鲜标本电网辉光放电，并应用到标本电网5μL稀释vRNP下降。
保留标本8分钟电网下降。
在等待，在板凳上的封口膜小片地方，并免除2滴10μL每个产妇和新生儿破伤风缓冲区（洗电网），和一个新鲜的染色溶液80μL下降（1％钼酸铵或1 ％醋酸双氧铀）上的封口膜。
吸附的8分钟后，灯芯从样品溶液的滤纸标本网格（切成三角形）的一部分。不要让干的标本电网。
2含1分钟的总时间为产妇和新生儿破伤风缓冲区各10μL滴标本电网清洗。这样做是通过仔细的下降降低试样的网格，然后排汗关闭部分样品溶液的滤纸标本网格（而不让试样电网干）。
后立即排汗的缓冲区从标本电网的最后一滴，完成LY淹没的标本染色液滴内的电网，并等待1分钟。
完全灯芯染色滤纸标本电网解决方案。
允许风干的标本透射电子显微镜下观察前几分钟电网。

第6部分：代表性的成果：

图1

由于A型流感NP（〜56 kDa）的蛋白在病毒核蛋白复合物中发现的主要，NP带一般是最强的乐队在vRNPs（图1）的分数。除了到NP，每个流感vRNP还包含一个三聚体的RNA聚合酶（82，86和86.5 kDa的分子量）复杂的副本。这些可能会或可能不会考马斯亮蓝染色可见的，因为他们的丰度相比是低的NP。然而，聚合酶，可以检测到，而不是一个Commassie蓝染色，凝胶进行银染。流感基质蛋白M1（〜28 kDa）的，应最低限度在目前存在的NP蛋白峰分数的分数。

图2

负染色透射电子显微镜下观察vRNPs应该产生类似于可变长度的杆状颗粒约30纳米，长度为120纳米（图2a）vRNPs。低聚NP是一个NP的分子链进一步折叠成一个双螺旋重复结构的组织，如此循环，有时可以看到（图2b），这些杆状颗粒的两端。

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Discussion

vRNPs净化Kemler 等人（1994年）所描述的程序的基础上，我们和其他人也用此协议隔离vRNPs，研究它们^的核进口。2,4,5

我们建议使用无RNase的技巧和操纵vRNPs管时，因为病毒基因组RNA的组成，因此很容易降解的RNA的存在。此外，所有的缓冲区，应即核糖核酸免费的水。这里所描述的协议，是一种酸性提取（如中断缓冲区和甘油梯度的pH值是5.5）。同样，一个基本的提取可以代MES，pH值5.5，pH值7.8用Tris（Kemler 等人（1994年^）1所述）。

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Acknowledgments

这项工作是由加拿大创新基金会（CFI），加拿大卫生研究所（CIHR）学院，以及自然科学与工程研究理事会（NSERC），加拿大的赠款支持。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A	Charles River Laboratories	490715
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
MES	Sigma-Aldrich	M-8250
Glycerol	Fisher Scientific	G33-1
Octylglucoside	Sigma-Aldrich	O-8001
Lysolecithin	Sigma-Aldrich	L-4129
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D-9779
Coomassie brilliant blue G-250	Kodak	1367796
diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water	Invitrogen	750024
Uranyl Acetate	Ted Pella, Inc.	19481
Ammonium Molybdate	Fisher Scientific	A-674
Optima MAX-E Ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.	434491
MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket	Beckman Coulter Inc.	367280
TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium	Beckman Coulter Inc.	362046
Eppendorf Thermomixer	Lauda Brinkmann	022670000