Summary
Influenza A virüsünün genomu sekiz ayrı kompleksleri, RNA ve protein olarak adlandırılan viral ribonükleoprotein kompleksleri (vRNPs) oluşur. Bu yazıda, gliserol degrade arıtma ve influenza A vRNPs transmisyon elektron mikroskobu görselleştirme açıklamaktadır.
Abstract
Influenza A viral genomun viral ribonulceoprotein parçacıklar (vRNPs) içine İnfluenza A nükleoprotein (NP) birden fazla kopyası ile ayrı ayrı paketlenmiş sekiz negatif anlamda, tek sarmallı RNA molekülleri oluşur. Influenza vRNPs viral zarf içine. Hücreye girişi sırasında konak nükleer taşıma makine erişmek, ancak, bu vRNP kompleksleri, sitoplazma içine salınır. , Grip vRNPs ve grip genomunun çoğaltma nükleer ithalat incelemek üzere, bu virüsün diğer bileşenler bu süreçlerin karışmaz böylece izole vRNPs çalışmak için yararlıdır. Burada, influenza A virüsünün bu vRNPs arındırmak için bir prosedür açıklanmaktadır. Prosedür zarflı virion vRNP kompleksleri serbest bırakmak amacıyla grip deterjanlarla virion bozulma ile başlar. VRNPs sonra grip hız sedimantasyon% 33-70 süreksiz gliserol degrade virion diğer bileşenler ayrılır. Gliserol gradiyenti elde kesirler sonra Coomassie mavi ile boyandıktan sonra SDS-PAGE ile analiz edilir. NP içeren pik fraksiyonları daha sonra bir araya toplanmış ve santrifüj yoluyla yoğunlaşmıştır. Konsantrasyon sonra, vRNPs bütünlüğünü negatif boyandıktan sonra transmisyon elektron mikroskobu ile vRNPs görselleştirme tarafından doğrulanmadı. Gliserol degrade arıtma Kemler o bir değişiklik
Protocol
Bölüm 1: Grip bozulması bir virion
- Beckman Optima kullanmak için TLA-120,2 rotor içine sığacak şekilde tasarlanmış bir Beckman polikarbonat santrifüj tüpüne (11 mm x 34 mm) içine MNT tampon 750 ul (20 mM (MES), 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7.5) Max-E ultrasantrifüjdeki.
- Bu tüpe, influenza A virüsünün (2 mg / ml 'H3N2 X-31 A/AICHI/68 suşu) 500 ul ekleyin. MNT tamponu ile birkaç kez aşağı yukarı pipetleme virüs karıştırın.
- TLA-120,2 rotor kullanarak Beckman Optima Max-E santrifüj, 109.000 xg, 4 ° C 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Süpernatantı ve 500 ul bozulması tampon pelet (100 mM KCl, 5 mM MgCl 2,% 5 (w / v) gliserol, 50 mM octylglucoside, 10 mg / ml lysolecithin, 1.5 mM dithiothreitol, 100 mM MES, tekrar süspansiyon pH 5.5).
- Vorteks şiddetle ve sonra sallanarak 31 ° C'de 20 dakikada bir Eppendorf Thermomixer.
Bölüm 2: Gliserol Gradient Tortu Hız Santrifüj
- Gliserol degrade aşağıdaki miktarda gliserol 1 ml% 70 (v / v) gliserol, 0.75 ml% 50 gliserol, 0.375 ml% 40 gliserol ve 1.8 Beckman ultraclear santrifüj tüpüne (13 mm x 51 mm) içine koyarak hazırlayın ml% 33 gliserol. Gliserol çözümleri saf gliserol NM tampon (150 mM NaCl, 50 mM (MES), pH 5.5) ile karıştırılarak yapılır. Ayrıca, gliserol ve tampon her ikisini de içeren bir denge tüp hazırlayın.
- Vorteksleyin tekrar viral örnek bozulur ve gliserol degrade üzerine yükleyin.
- Beckman MLS-50 sallanan kovalı rotor, 217.000 xg, 4 ° C 3,75 saat degrade santrifüjleyin.
- Santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra, tüpün üst başlayarak degrade 250 ul alikotları elle toplamak. ° C buz veya 4 kesirleri tutun
Bölüm 3: SDS Poliakrilamid Jel Elektroforez Gliserol Gradient Kesirler Analizi
- Her bir fraksiyon taze bir tüp 20 ul çıkarın.
- 5x SDS-PAGE örnek tampon 5 ul ekleyin.
- Isı 95 ° C'de 5 dakika.
- Kısaca numuneler Spin ve% 10 poliakrilamid jel üzerine yük ve kuyulardan birinde molekül ağırlığı işaretleri içerir.
- Bromphenol mavi yükleme boya jel altına yakın ulaşıncaya kadar jel örnekleri çalıştırın.
- Coomassie mavi jel Leke.
Bölüm 4: vRNP Kesirler Konsantrasyon
- Esas NP içeren gliserol kesirler seçin, bunları birleştirmek ve iki Beckman polikarbonat santrifüj tüpleri (11 mm x 34 mm) içine dağıtmak.
- Dietil pyrocarbonate (DEPC) ile tedavi edilen Ultra Saf su, ve pipetlemeyin yukarı ve aşağı karıştırmak için birkaç kez her tüp doldurun.
- Beckman TLA-120,2 rotor 157.000 xg, 4 ° C, 4,5 saat boyunca santrifüjleyin.
- Süpernatantı ve DEPC arıtılmış su 50 ul pelet tekrar süspansiyon haline getirin.
- Eğer istenirse, konsantre vRNPs A 280 ölçülebilir. NP toplanmış fraksiyonları önemli bileşeni mevcut olduğu gibi, NP molarite bir tahmini 55.350 sönüm katsayısı M -1 cm -1 (ProtParam 3 ile belirlenir) kullanılarak hesaplanabilir.
- Kısım saflaştırılmış vRNPs ve bunları daha sonra kullanmak üzere ° C -80 dondurulmuş saklamak.
Bölüm 5: vRNPs Negatif Boyama
- 9 ul saflaştırılmış vRNP 1 ul sulandırınız taze ve süzülmüş iki kez MNT tamponu (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7.5). Diğer tamponlar da vRNPs sulandırmak için örnek ızgara (adım 5.5) yıkamak için OK, ama eğer PBS uranil asetat negatif boyanması için kullanılır kullanmayın.
- Kızdırma deşarj daha önce 30 saniye boyunca bir parlodion ve karbon film ile kaplı bir örnek (bakır TEM) grid.
- Cımbız ile taze parlayan taburcu bir örnek ızgara tutun ve numune ızgara üzerine seyreltilmiş vRNP 5-ul damla uygulayın.
- 8 dakika ızgara üzerinde numunenin damla bırakın.
- Parafilm bir bankta beklerken, küçük bir şerit yerleştirin içeren 10 ul her MNT tampon (ızgara yıkamak için), ve taze yapılmış boyama çözüm 80-ul damla (% 1 amonyum molibdat veya 1 2 damla dağıtmak Parafilm üzerine% uranil asetat).
- Adsorpsiyon 8 dakika sonra, filtre kağıdı bir parça numune ızgara (üçgen şeklinde kesilmiş) örnek çözüm parçası fitil. Örnek ızgara kurumasına izin vermeyin.
- 1 dakika olmak üzere toplam süre 10 ul MNT tampon içeren 2 damla örnek ızgara yıkayın. Bu örnek ızgara düşürücü dikkatle açılan ve daha sonra filtre kağıdı bir parça numune ızgara (örnek ızgara kuru izin vermeden) örnek çözüm parçası esneklik yapılır.
- Hemen örnek ızgara tampon son damlasına esneklik sonra, tamly batığın numune leke damlacık içinde ızgara ve 1 dakika bekleyin.
- Tamamen bir parça filtre kağıdı ile örnek ızgara leke çözüm fitil.
- Transmisyon elektron mikroskop altında gözlem önce birkaç dakika kurumasını örnek ızgara izin verin.
Bölüm 6: Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1
Influenza A NP (~ 56 kDa) gibi viral ribonükleoprotein kompleksleri bulunan başlıca protein, NP bant genellikle vRNPs (Şekil 1) içeren kesirleri güçlü grubudur. NP ek olarak, her grip vRNP trimerik RNA polimeraz (82, 86 ve 86.5 kDa molekül ağırlıkları) karmaşık bir kopyasını içerir. Bu olabilir veya kendi bolluk NP ile karşılaştırıldığında düşük olması nedeniyle Coomassie mavi boyama görünür olmayabilir. Polimerazları, ancak, bir Commassie mavi leke yerine, eğer, bir gümüş jel yapılır leke tespit edilebilir. İnfluenza matriks protein M1 (~ 28 kDa) NP protein zirve kesirler kesirler minimal olmalıdır.
Şekil 2
Olarak olumsuz bir transmisyon elektron mikroskobu altında görüntülendi lekeli vRNPs uzunluğu 120 nm (Şekil 2a), yaklaşık 30 nm değişken uzunlukta çubuk şeklindeki parçacıkların benzer vRNPs verim gerekir. Oligomerik NP NP moleküllerin bir zincir, bir çift sarmal tekrar yapısı daha içine katlanmış olarak düzenlenen, bu nedenle bu çubuk şeklindeki parçacıkların iki ucunda döngüler bazen görülebilmektedir (Şekil 2b).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
VRNPs Arındırma Kemler ve ark (1994) tarafından açıklanan prosedüre dayanmaktadır. 1. Biz ve diğerleri de kendi nükleer ithalat çalışma vRNPs izole etmek için bu protokolü kullanılır. 2,4,5
RNA viral genomun oluşur çünkü RNaz ücretsiz ipuçları ve tüpler vRNPs manipüle kullanmanızı tavsiye ederiz ve bu nedenle RNA varlığı kolayca düşürür. Buna ek olarak, tüm tamponlar RNaz ücretsiz su yapılmalıdır. Burada açıklanan protokol asidik bir ekstraksiyon (örneğin bozulması tamponu ve gliserol degrade pH 5.5) ile yapıldı. Benzer şekilde, temel bir çıkarımı, MES, Tris, pH 7.8 ile pH 5.5 yerine (Kemler ve ark (1994) 1 tarafından açıklandığı gibi) olabilir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, Kanada Yenilik Vakfı (CFI), Kanada Sağlık Araştırmaları (CIHR) Enstitüsü, Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Kurumu (NSERC) hibe ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A | Charles River Laboratories | 490715 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M-8250 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-1 | |
| Octylglucoside | Sigma-Aldrich | O-8001 | |
| Lysolecithin | Sigma-Aldrich | L-4129 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D-9779 | |
| Coomassie brilliant blue G-250 | Kodak | 1367796 | |
| diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water | Invitrogen | 750024 | |
| Uranyl Acetate | Ted Pella, Inc. | 19481 | |
| Ammonium Molybdate | Fisher Scientific | A-674 | |
| Optima MAX-E Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 434491 | |
| MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket | Beckman Coulter Inc. | 367280 | |
| TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium | Beckman Coulter Inc. | 362046 | |
| Eppendorf Thermomixer | Lauda Brinkmann | 022670000 |
References
- Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins. Virology. 202, 1028-1033 (1994).
- Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes. J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).
- Gasteiger, E. The Proteomics Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. 571-607 (2005).
- Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Panté, Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein. Virol J. 4, 49-49 (2007).
- Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes. Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).
