Summary
هذا البروتوكول يوضح كيفية تشريح
Abstract
و
Protocol
قبل أن تبدأ
- وينبغي أن تزرع في كل الثقافات 25 درجة مئوية.
- قد تكون على استعداد HL3.1 العازلة تشريح مقدما. اتخاذ قسامة 50 مل من HL3.1 وابقائه على الجليد.
- تحضير 15 مل من فورمالديهايد الطازجة بنسبة 3.5 ٪ في HL3.1. يبقيه على الجليد.
اليرقات تشريح
- وضع قطرة من HL3.1 الباردة على لوحة التشريح. هذا وسوف تبقي الحيوان من التجفيف وصعق الحيوان مما يسهل التعامل معها.
- باستخدام ملقط طويل ، حدد تجول اليرقة طور مرحلي الثالث ووضعه في قطرة من HL3.1.
- أولا ، استخدام الملقط قصيرة لاستيعاب دبوس minutien. وضع دبوس بين spiracles الخلفي. والحيوان وعادة ما يحاول الزحف بعيدا عن دبوس تمتد نفسها بنفسها ، وجعل من الأسهل بالنسبة لك لوضع دبوس في رأسه بشكل مباشر من يرقة بالقرب من السنانير الفم. تمتد طوليا من أصل الحيوان. هذا سيساعدك على أقصى قدر من جدار الجسم يتعرض يمكنك تحقيق خلال عدة قطاعات. ملاحظة : إذا اخترت دبوس أول رئيس والحيوان قد التفاف حول جسمها دبوس أو سوط الهيئة ذهابا وإيابا مما يجعل من الصعب دبوس. يمكنك مواجهة هذا عادة عن طريق إزالة HL3.1 ووضع قطرة باردة جديدة مذهلة الحيوان مرة أخرى. لا يمكن للعالم أيضا ضبطاء مجرد الاستيلاء على الحيوان والاحتفاظ بها في مكان.
- مقص الربيع باستخدام إجراء شق أفقي الأمامي لمجرد دبوس الخلفي على الجانب الظهري من اليرقة. مكان واحد شفرة المقص في شق وجعل قطع رأسي على طول خط الوسط ظهري باتجاه نهاية منقاري من اليرقة. على المنصة من الحيوان جعل شقوق الأفقية إلى اليسار واليمين من دبوس. ملاحظة : النتيجة النهائية يجب أن تبدو وكأنها أنا على الجانب الظهري لليرقة على طول محور rostrocaudal.
- إزالة الأجهزة. تبدأ من خلال وضع العديد من نقاط إضافية HL3.1 على يرقة. وهذا سيمكن أجهزة لتعويم ما يصل إلى خارج الجسم مما يسمح لك لإزالتها بسهولة أكبر بكثير. أولا ، إزالة نظام القصبة الهوائية. ثانيا ، استخدام ملقط لانتزاع ما تبقى من الأجهزة وإزالتها.
- خلال الخطوة 3 جعلتك رفرف رفرف اليسار واليمين في جدار الجسم. دبوس اللوحات في ترتيب عقارب الساعة مع التأكد من امتداد جدار الجسم أفقيا ورأسيا.
تثبيت
الإصلاح في كل حيوان الفورمالديهايد بنسبة 3.5 ٪ في HL3.1 لمدة 25 دقيقة. غسل الحيوانات مرتين في HL3.1 لمدة 5 دقائق.
تخزين
إزالة المسامير ونقل اليرقات إلى أنبوب 1.5 مل تحتوي على 1X PBS. إذا كنت تخطط لاستخدام صورة NMJ به نيون تنصهر فيها ، يجب أن صورة الحيوانات في غضون يومين. قد قمت بتخزين اليرقات تشريح لمدة تصل إلى أسبوع واحد في 4 درجة مئوية.
ممثل النتائج
هناك عدة عناصر رئيسية ليرقة ذبابة الفاكهة تشريح بشكل صحيح. أولا ، لا بد من اتخاذ المزيد من الحيطة لا يلحق الضرر العضلات ، وخاصة عضلات 4 و 6 و 7. هذه هي عضلات الأكثر شعبية للدراسة ، وإذا كانت معطوبة تجاهل الإعدادية فيليه وتشريح حيوان آخر. ثانيا ، يجب على المرء أن تأكد من أن يتم تمديد الحد الأقصى الحيوان بحيث يمكن تمييز كل العضلات وNMJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمكن استخدام هذه التقنية أظهر تشريح في هذا الفيديو لإعداد يرقات ذبابة الفاكهة لمجموعة متنوعة من التقنيات التجريبية. إذا به بروتين فلوري موجودة ، ويمكن تحميل واليرقات والتقط على الفور. خلاف ذلك ، يمكن أن يؤديها من أجل immunostaining علامة مقصورات متشابك محددة. بالإضافة ، يمكن بسهولة أن يؤديها الكهربية على يرقات تشريح لتقييم أداء النقل العصبي.
اكتسبت NMJ من ذبابة الفاكهة بشعبية كبيرة منذ أوائل الدراسات التي مضيئة هيكلها الأساسي ووظيفتها. 1-4 والحفظ وكثير من الجزيئات التي تم التعرف عليها في دراسات تطوير NMJ ذبابة الفاكهة في الفقاريات. 4 لذلك ، فإن العديد من رؤى المستفادة من خلال دراسات للذبابة الفاكهة NMJ تنطبق على البيولوجيا متشابك في جميع الكائنات الحية. بعض التطبيقات الممكنة تشمل دراسة الجزيئات تشارك في توجيه محور عصبي ، الأمراض العصبية الحركية ، والتعلم ، والذاكرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | Long forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Short forceps |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | Used to make dissection plates |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549-25ML | |
| Stainless Steel Minutien Pins -0.1 MM Diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| HL3 Dissection Buffer: (in mM) 70 NaCl, 5 KCl, 0.2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalose, 115 sucrose, and 5 HEPES, pH 7.3. Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
|||
Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
|||
Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
|||
| Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. | |||
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. , 73-1137 (1993).
- Feng, A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
