Summary
此协议示范如何解剖
Abstract
“
Protocol
在您开始之前
- 所有的文化应该是生长在25 ° C
- HL3.1清扫缓冲区可能提前做好准备。以50毫升的HL3.1等份，并保持它在冰上。
- 准备在HL3.1 15毫升新鲜的3.5％的甲醛。保持它在冰上。
幼虫解剖
- 放一个寒冷HL3.1的夹层板的下降。这将保持干燥和眩晕的动物，使其更容易与动物。
- 用长镊子 ，选择一个流浪的第三龄幼虫和HL3.1下降。
- 首先，使用短钳把握minutien针 。放置后气孔之间的引脚。动物通常会试图抓取从引脚本身拉伸，使它更容易为您放置在头口附近挂钩的幼虫的一个引脚正视。纵向伸展的动物。这将有助于您最大限度地就可以实现在切割过程中暴露的体壁量。注：如果您选择引脚头，动物可能会引脚环绕其身，或使其难以引脚，它的身体上来回鞭。通常你可以反删除HL3.1，并再次把一个新鲜的冷下降惊人的动物。灵巧的科学家也可以只抓动物和举行到位。
- 使用弹簧剪刀水平切口，只是前幼虫背侧后针。切口放入一个刀片剪刀，沿背中线对幼虫的喙的垂直切割。在动物的讲台，使针左侧和右侧横切口。注：完成的结果看起来应该像对我幼虫背侧沿rostrocaudal轴。
- 取出的器官。开始把一些额外的下降HL3.1幼虫。这将使机关浮出来的身体，让你更容易将其删除。首先，取出气管系统。二，使用镊子抢其余的器官，并删除它们。
- 在第3步，左瓣体壁和右瓣。引脚以顺时针为了确保横向和纵向拉伸体壁的襟翼。
固定
修正在3.5％甲醛25分钟在HL3.1，每个动物。洗两次HL3.1动物为5分钟。
存储
删除引脚和幼虫转移到1.5 ml管中含有1 × PBS。如果您计划NMJ使用融合荧光标记的图像，你应该在两天内的动物形象。您可能会存储一个星期的解剖幼虫在4 ° C
代表性的成果
有几个关键组件的正确解剖果蝇幼虫。首先，必须格外小心，不损伤肌肉，特别是肌肉4，6，和7。这些是最流行的肌肉研究，如果它们已损坏丢弃圆角的准备和解剖其他动物。其次，必须确保该动物是最大限度地伸展，使每一块肌肉和NMJ可以区分。
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Discussion
在此视频中演示的剥离技术可用于准备各种实验技术的果蝇幼虫。如果荧光蛋白标记，幼虫可安装和成像立即。否则，免疫，可为了纪念特定的突触车厢。此外，电可以轻松地进行解剖幼虫，以评估神经递质的运作。
果蝇 NMJ年初以来，照亮它的基本结构和功能的研究已取得大受欢迎。1-4许多对果蝇NMJ的发展的研究中已确定的分子在脊椎动物保守。 4因此，许多通过果蝇 NMJ的研究中吸取的见解，是适用于一切众生突触生物学。一些可能的应用包括参与轴突导向分子的研究，运动神经元疾病，学习和记忆。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | Long forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Short forceps |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | Used to make dissection plates |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549-25ML | |
| Stainless Steel Minutien Pins -0.1 MM Diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| HL3 Dissection Buffer: (in mM) 70 NaCl, 5 KCl, 0.2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalose, 115 sucrose, and 5 HEPES, pH 7.3. Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
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Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
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Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
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| Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. | |||
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. , 73-1137 (1993).
- Feng, A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
