Summary
Dit protocol laat zien hoe om te ontleden
Abstract
De
Protocol
Voordat u begint
- Alle culturen moeten worden gekweekt bij 25 ° C.
- HL3.1 dissectie buffer kunnen worden bereid op voorhand. Neem een 50 ml van HL3.1 en houd het op ijs.
- Bereid 15 ml vers 3,5% Formaldehyde in HL3.1. Hou het op het ijs.
Larvale Dissection
- Doe een druppel van koude HL3.1 op de dissectie plaat. Dit zorgt ervoor dat het dier uit drogen en stun het dier waardoor het makkelijker wordt om mee te werken.
- Met behulp van de lange tang, selecteert u een zwervend derde instar larven en plaats deze in de daling van HL3.1.
- Gebruik eerst kort een tang om een minutien pin te grijpen. Plaats de pin tussen de achterste siphonen. Het dier zal meestal proberen weg te kruipen van de pin rekken zich uit en maakt het makkelijker voor u om een speld vierkant plaats in de kop van de larve in de buurt van de mond haken. Strek het dier uit de lengte. Dit zal u helpen maximaliseren van de hoeveelheid van de blootgestelde lichaam wand je kunt bereiken tijdens het snijden. Opmerking: Als u ervoor kiest om het hoofd eerste pin, het dier kan zijn lichaam wrap rond de pen of haar lichaam heen en weer zweep waardoor het moeilijk vast te pinnen. Kun je meestal dit tegen te gaan door het verwijderen van de HL3.1 en zetten een frisse koude druppel verbluffende het dier weer. De symmetrische wetenschapper kan ook gewoon grijpen het dier en zijn plaats te houden.
- Met behulp van de lente schaar maken een horizontale snede net anterieur van de achterste pen op de dorsale zijde van de larve. Plaats een blad van de schaar in de incisie en maak een verticale snede langs de dorsale middellijn in de richting van de rostrale einde van de larve. Op het podium van het dier te maken horizontale incisies naar links en rechts van de pin. Let op: het uiteindelijke resultaat eruit moet zien als een I op de dorsale zijde van de larve langs de rostrocaudal as.
- Verwijder de organen. Begin met het zetten een aantal extra druppels HL3.1 op de larve. Hierdoor kunnen de organen op te drijven uit het lichaam zodat u ze te verwijderen veel gemakkelijker. Verwijder eerst de tracheale systeem. Ten tweede, gebruik de tang om de rest van de organen te pakken en te verwijderen.
- Bij stap 3 hebt gemaakt een linker en rechter flap flap in het lichaam muur. Speld de kleppen in een met de klok mee om en zorg ervoor dat het lichaam muur rekken zowel horizontaal als verticaal.
Bevestiging
Fix elk dier in 3,5% formaldehyde in HL3.1 voor 25 minuten. Was het dier tweemaal in HL3.1 gedurende 5 minuten.
Opslagruimte
Verwijder de pennen en de overdracht van de larven naar een 1,5 ml buis met 1X PBS. Als u van plan bent om het imago van de NMJ met gesmolten fluorescerende labels, moet u het imago van de dieren binnen twee dagen. U mag de ontleed larven gedurende maximaal een week bij 4 ° C.
Representatieve resultaten
Er zijn een aantal belangrijke componenten voor een goed ontleed Drosophila larve. Ten eerste moet men rekening extra zorg niet naar de spieren, in het bijzonder de spieren 4, 6 en 7 schade. Dit zijn de meest populaire spieren om te studeren en als ze beschadigd zijn gooi de filet prep en ontleden een ander dier. Ten tweede, moet men ervoor zorgen dat het dier maximaal is zo uitgerekt dat elke spier en NMJ kunnen worden onderscheiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De dissectie techniek gedemonstreerd in deze video kan worden gebruikt om Drosophila larven voor te bereiden op een verscheidenheid aan experimentele technieken. Als fluorescerend eiwit labels aanwezig zijn, kunnen de larven worden gemonteerd en direct afgebeeld. Anders kan immunokleuring worden uitgevoerd om bepaalde synaptische compartimenten te markeren. Daarnaast kan elektrofysiologie gemakkelijk worden uitgevoerd op de ontleed larven van de werking van neurotransmissie te evalueren.
Het NMJ van Drosophila heeft opgedaan grote populariteit sinds het begin van de studies die zijn fundamentele structuur en functie verlicht. 1-4 Veel van de moleculen die zijn geïdentificeerd in studies van de ontwikkeling van de Drosophila NMJ worden bewaard in gewervelde dieren. 4 Daarom zijn veel van de inzichten geleerd door middel van studies van de Drosophila NMJ zijn van toepassing op synaptische biologie in alle levende wezens. Enkele mogelijke toepassingen zijn de studie van de moleculen die betrokken zijn bij axon begeleiding, motor neuron ziekte, leren en geheugen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| 3mm Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-0 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | Long forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Short forceps |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | Used to make dissection plates |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549-25ML | |
| Stainless Steel Minutien Pins -0.1 MM Diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| HL3 Dissection Buffer: (in mM) 70 NaCl, 5 KCl, 0.2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalose, 115 sucrose, and 5 HEPES, pH 7.3. Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
|||
Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
|||
Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. |
|||
| Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator. | |||
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. , 73-1137 (1993).
- Feng, A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
