Microinjeção é um método bem estabelecido e eficaz para a introdução de substâncias estranhas em embriões de peixe-zebra fertilizado. Aqui, nós demonstramos uma técnica de microinjeção robusta para a realização de superexpressão do mRNA, e oligonucleotídeos morfolino estudos gene knockdown no zebrafish.
Abstract
Uma ferramenta essencial para investigar o papel de um gene durante o desenvolvimento é a capacidade de executar knockdown do gene, superexpressão e estudos misexpression. Em peixes-zebra (<em> Danio rerio</em>), Microinjeção de RNA, DNA, proteínas, oligonucleotídeos antisense e outras moléculas pequenas para o desenvolvimento do embrião fornece aos pesquisadores um ensaio rápido e robusto para explorar a função do gene<em> In vivo</em>. Neste vídeo-artigo, vamos demonstrar como preparar e microinject<em> In vitro</em> MRNA sintetizado EGFP e uma translação de bloqueio de morfolino oligo contra<em> PKD2</em>, Um gene associado à doença renal policística autossômica dominante (ADPKD), em 1 de células de embriões zebrafish palco. Vamos então analisar o sucesso do mRNA e microinjeções morfolino verificando expressão GFP e análise de fenótipo. Amplas aplicações desta técnica incluem a geração de animais transgênicos e células germinativas quimeras, célula-destino de mapeamento e seleção genética. Aqui nós descrevemos um protocolo para a superexpressão de EGFP e knockdown de<em> PKD2</em> Por mRNA e injeção de oligonucleotídeos morfolino.
Protocol
Parte 1: Preparação de micropipetas, e placas de câmara de microinjeção Fabricar micropipetas por aquecimento e puxar os tubos de vidro de borosilicato capilar (Precision Mundial Instruments, Inc., 1B100-4) em um dispositivo extrator micropipeta (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brown P-97). Armazenar em uma placa de Petri em cima de pequena quantidade de barro ou fita adesiva. Despeje de agarose 1,5% (American Bioanlytical, Inc., AB00972-00500) em placas 1x médio E3 moldado com depressões …
Discussion
Microinjeção em embriões de peixe-zebra é uma técnica bem estabelecida e robusta para explorar o papel de um gene em particular no desenvolvimento. As aplicações incluem superexpressão, misexpression e ensaios knockdown do seu gene de interesse, bem como análise epistáticas entre genes múltiplos. Microinjeção em peixes-zebra tem sido amplamente utilizada para a geração de animais transgênicos, células e mapeamento de destino no início de embriões blástula 5,6,7,8,9. Além disso, a aplicaç…
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH e fundação PKD a ZS. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com Yale Recursos Animais Center (YARC) e Animal Care Institucional e Use Committee (IACUC) orientações.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
1x E3 Medium
Reagent
5 mM NaCl
0.17 mM KCl
0.33 mM CaCl2
0.33 mM MgSO2
0.1% Methylene blue
Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.. J. Vis. Exp. (27), e1113, doi:10.3791/1113 (2009).