Summary
Deze procedure maakt gebruik van een blauw licht geactiveerd algen kanaal en cel-specifieke genetische expressie tools om synaptische potentialen op te roepen met lichtpulsen op de neuromusculaire junctie (NMJ) in
Abstract
De
Protocol
Deel 1: Animal zorg en genetische kruisingen
- Onderhouden UAS-ChR2 en OK371-GAL4 fly-lijnen in aparte flessen die standaard vliegen media 8.
- Verzamel maagden van OK371-GAL4 vliegen lijnen en mannen van UAS-ChR2 lijnen.
- Zet zowel mannen en vrouwen in een flacon met standaard vliegen media gemengd met 1 mM all-trans retinal (ATR). ATR voedsel moet worden gemaakt door eerst smelten reguliere media vliegen in een magnetron voor ~ 1 minuut. Eenmaal gesmolten is, laat het voor ongeveer 30 seconden af te koelen tot een minuut en daarna 100 ul van 100 mM ATR in 100% EtOH voor elke 10 ml van vliegen media toe te voegen. Plaats flacons op het ijs, vervolgens op te slaan in een donkere ruimte bij 4 ° C.
- Laat vliegt paren en leggen eieren in een donkere ruimte bij 22-25 ° C.
- Wacht 3-4 dagen tot de 3de instar larven zichtbaar zijn, op dat moment, beschikken over volwassen vliegen.
Deel 2: Rig setup
- Bevestig een 10x ontleden omvang oog stuk (in ons geval, van Carl Zeiss Inc, www.zeiss.com, Thornwood, NY), met blauwe LED-lichtbron met koellichaam (Thor laboratoria, www.thorlabs.com, Newton, NJ ). Hechten aan magnetische voet met post en klem. Bedek het koellichaam met een elektrisch geaard zijn schild om elektrische ruis gegenereerd door het licht bron te verminderen.
- Plaats magnetische voet met lichtbron op lucht tafel van de elektrofysiologie rig.
- Sluit de lichtbron circuit controle en controle circuit aansluiten op een externe spanningsbron (Powerlab 4 / 30, ADInstruments, www.adinstruments.com, Colorado Springs, CO).
- Geef 1 tot 5 V pulsen om circuit controle om blauw licht te activeren.
- Pas de magnetische voet en de lichtbron tot blauw licht bundel is gericht op het gebied dat moet worden ingenomen door larven dissectie.
Deel 3: Dissection
- Plaats zes 0,1 mm insect pennen in de vloer van een Sylgard beklede schaal.
- Verwijder een 3 e instar larven van voedsel media en plaats in een plastic Petri-schaal.
- Spoel larven met een zoutoplossing om voedsel te verwijderen.
- Plaats larven in de buurt van de schotel ontleden getrokken pinnen en voeg zout tot ½ niveau.
- Plaats de larven, zodat u kunt zien twee zilveren buizen (trachea) langs dorsaal van het dier oppervlak.
- Rechtstreeks invoegen een grote pin in de staart tussen de tracheale buizen. Houd de larven naar beneden en plaats een tweede grote pin in zijn hoofd, en zorg ervoor dat het lichaam de lengte uitstrekken.
- Maak een kleine incisie in de buurt van de staart, en ga het op de lengte van het lichaam. Zorg ervoor dat de uiteinden van de schaar zo zijn opgevoed als u niet per ongeluk snijden ventrale zenuwen en / of lichaam muur spieren.
- Plaats vier pinnen op de vier hoeken van het dier nu open buik. Stel ze in het ontleden schotel om zo filet het dier. Pin voorbereiding van geleerd.
- Met behulp van tangen en scharen, verwijder het dier lef, de luchtpijp en vet lichamen.
- Spoel de prep met een zoutoplossing.
- Zoek de frontale kwabben (zoals te zien in figuur A) en ventrale ganglion van de prep.
- Met behulp van micro-schaar, knip voorzichtig door het ventrale ganglion net achter de frontale kwabben.
Deel 4: Muscle opname en blauw licht stimulatie
- Trek een 10-20 μω elektrode met behulp van een elektronische elektrode trekker (Sutter Instruments).
- Vul de getrokken elektrode met 3 M KCl.
- Plaats gevulde elektrode in elektrode houder en manoeuvreren elektrode met een micromanipulator de buurt van larvale prep onder dissectiemicroscoop op elektrofysiologie rig.
- Identificeer Muscle 6 (M6) in een lichaam muur segment (afb. A).
- Schuif elektrode in M6 en kijk voor een snelle hyperpolarisatie. Muscle rust membraan potentials moeten overal van -30 mV tot -70 mV.
- Stel blauw licht, zodat ontleed prep is gecentreerd in lichtbundel.
- Geef 20-100 ms spanningspulsen naar circuit te controleren. Stapsgewijs te verhogen voltage geleverd aan circuit te controleren. Kijk uit voor excitatoire knooppunt potentieel in de spiercel (Figuur 1B).
Representatieve resultaten:
Figuur 1A toont een schematische weergave van de opname installatie en gefileerd voorbereiding. Figuur 1B toont typische EJP opgeroepen door korte lichtpulsen. Getoond EJP amplitude is samengevat amplitude van twee motorneuronen bekend bij beide innerveren M6. Lagere lichtintensiteit ingeschakeld slechts een aandrijving (gegevens niet getoond).
Figuur 1: A) Algemeen schema van een intracellulaire opname tuigage en met blauwe LED. Brain (Br) is verwijderd om ritmische activiteit te remmen in de ventrale ganglion (VG). ChR2 wordt uitgedrukt in de motorische neuronen met behulp van de GAL4-UAS-systeem. B) Intracellulaire opname van een M6 spier. 40 ms blauw licht pulsen (op 127 μW / mm 2) op betrouwbare wijze op te roepen grote synaptische potentialen (sterretjes) in M6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen omvatten zowel de initiële dissectie en het invoeren van spiercellen. Als zenuwen zijn doorgesneden of spier is beschadigd tijdens de eerste dissectie is het moeilijk om door te gaan de rest van het experiment. Tijdens de dissectie, moet men zeer voorzichtig te ontleden schaar omhoog zoveel mogelijk hoek tijdens de dorsale incisie. Tijdens de tweede cruciale stap, het invoeren van een spiercel, moet men kijken naar een hyperpolarisatie verleden ~ 30 mV. Waarden boven de -30 mV geven aan dat de elektrode of niet goed is binnen een spiercel of in een ongezonde cel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health beurzen RO1GM-33205 en de MH-067284 naar LC Griffith en door een Brandeis University zomer undergraduate research beurs NJ Hornstein. Voorlopige experimenten voor deze techniek werden uitgevoerd bij de Marine Biological Laboratory in het kader van de 2008 Neural Systems and Behavior zomer cursus (NIMH te verlenen: R25 MH059472) in Woods Hole, Massachusetts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | 4019862 | www.ellsworth.com |
| Minutens Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | www.finescience.com |
| Dissecting Dish | Fisher Scientific | www.fishersci.com | |
| Neuroprobe Intracellular Amplifier and Head Stage | A-M Systems | 680100 | www.a-msystems.com |
| Powerlab 4/30 data acquisition system |  ADInstruments |
www.adinstruments.com | |
| Grass stimulator | Grass Technologies | www.grasstechnologies.com | |
| Desktop Computer | Dell | www.dell.com | |
| Dissecting Scope | Leica Microsystems | www.leica-microsystems.com | |
| Light Source | Dolan-Jenner Industries | 41446-062 | www.dolan-jenner.com |
| Fly Media | |||
| All-Trans-Retinal | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | www.sigmaaldrich.com |
| OK-371 Gal4 Flies | Bloomington Stock center | ||
| UAS-ChR2 Flies | Fiala lab, Griffith lab | ||
| LED controller circuit | Built in Griffith lab | http://www.ledsupply.com http://www.futureelectronics.com Composed of: 1. 200 mA Buck Puck 2. Blue LED 3. Insulated wire 4. Circuit bread board |
|
| LED Heat Sink | Thorlabs Inc. | http://www.thorlabs.com/ | |
| Air Table | TMC | http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html | |
| Faraday Cage | Built in Griffith lab | ||
| Leica Leitz M Micro-Manipulator | Leica Microsystems | ACS01 | www.leica-microsystems.com |
| Electrode Holder | Axon Instruments | www.axon.com | |
| Borosilicate Glass | FHC, Inc. | www.fh-co.com/p14-15.pdf | |
| Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | www.sutter.com | |
| HL 3.1 Saline with 0.8mM Ca2+ | Contents (mM): NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8 MgCl2:4Sucrose:115 NaHCO3: 10 Trehalose: 5 HEPES |
||
| Micro-Dissection Tools | Fine Science Tools | www.finescience.com |
References
- Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35 (2007).
- Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72 (2007).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940 (2003).
- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741 (2006).
- Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers. Neuron. 14 (4), 707 (1995).
- Ralph Greenspan, Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).
