Summary
Cette procédure utilise une lumière bleue-activé le canal d'algues et de cellules d'outils spécifiques d'expression génétique pour évoquer les potentiels synaptiques avec des impulsions de lumière à la jonction neuromusculaire (JNM) dans
Abstract
L'
Protocol
Partie 1: soins des animaux et de croisements génétiques
- Maintenir SAMU-CHR2 et des lignes de vol OK371-GAL4 dans des bouteilles séparées contenant des médias volent standard 8.
- Recueillir des lignes vierges volée OK371-GAL4 et les mâles de la SAMU-CHR2 lignes.
- Placez les deux mâles et les femelles dans un flacon contenant des médias volent standards mélangé avec 1 mM tout-trans rétinal (ATR). ATR alimentaires doit être faite par les médias fondre premier vol régulier dans un micro-ondes pendant environ 1 minute. Une fois fondu, laisser refroidir pendant environ 30 secondes à une minute, puis ajouter 100 ul de 100 mM dans 100 ATR ETOH% pour chaque 10 ml de médias voler. Flacons placer sur la glace, puis stocker dans un endroit sombre à 4 ° C.
- Laissez-mouches s'accouplent et pondent leurs œufs dans une zone sombre à 22-25 ° C.
- Attendre 3-4 jours jusqu'au 3 stades larvaires sont visibles; à ce point, disposer des mouches adultes.
Partie 2: configuration Rig
- Joindre toute pièce de dissection oeil 10x champ (dans notre cas, de Carl Zeiss Inc, www.zeiss.com, Thornwood, NY), à LED bleue source de lumière avec dissipateur thermique (laboratoires Thor, www.thorlabs.com, Newton, NJ ). Joindre à base magnétique avec message et pince. Couverture dissipateur de chaleur avec un bouclier électriquement à la terre pour réduire le bruit électrique généré par la source lumineuse.
- Placer la base magnétique avec source de lumière sur la table de l'air de l'électrophysiologie gréement.
- Connectez la source de lumière au circuit de commande et connectez circuit de contrôle à la source de tension externe (Powerlab 4 / 30, ADInstruments, www.adinstruments.com, Colorado Springs, CO).
- Donner des impulsions 1-5 V au circuit de commande pour activer la lumière bleue.
- Réglez la base magnétique et source de lumière jusqu'à ce faisceau de lumière bleue est axé sur la zone à être occupé par une dissection des larves.
Partie 3: Dissection
- Placez six broches de 0,1 mm d'insectes dans le sol d'un plat Sylgard-alignés.
- Supprimer un 3 ème stade larvaire à partir de supports alimentaires et les placer dans une boîte de Petri en plastique.
- Rincez les larves avec du sérum physiologique pour enlever la nourriture.
- Placer les larves de dissection plat près des broches tiré et ajouter une solution saline au niveau de ½.
- Orienter les larves de telle sorte que vous pouvez voir deux tubes argentés (trachée) qui longe la surface dorsale de l'animal.
- Insérer une grosse épingle directement dans la queue entre les tubes trachéaux. Tenir les larves et placer un second axe important dans sa tête, en étant sûr d'étirer le corps en longueur.
- Faire une petite incision près de la queue, et il continuera jusqu'à la longueur du corps. Assurez-vous que les pointes des ciseaux sont soulevées afin de ne pas accidentellement coupé les nerfs ventraux et / ou muscles de la paroi du corps.
- Placez quatre broches sur les quatre coins de l'animal est maintenant abdomen ouvert. Mettez-les dans le plat de dissection, afin de filet de l'animal. Préparation de Pin des enseignés.
- En utilisant des pinces et ciseaux, retirez tripes de l'animal, la trachée et corps gras.
- Rincer la préparation avec une solution saline.
- Repérez les lobes frontaux (comme on le voit dans la figure A) et le ganglion ventral de la préparation.
- En utilisant des micro-ciseaux, découpez soigneusement travers le ganglion ventral, juste derrière les lobes frontaux.
Partie 4: l'enregistrement et la stimulation musculaire lumière bleue
- Tirez une électrode 10-20 μω utilisant un extracteur d'électrode électronique (Sutter Instruments).
- Remplir l'électrode tiré avec 3 M de KCl.
- Placer l'électrode dans remplis porte-électrode et extrémité de l'électrode de manoeuvrer avec un micromanipulateur proximité de préparation des larves sous loupe binoculaire sur l'électrophysiologie gréement.
- Identifier Muscle 6 (M6) dans tout segment de la paroi du corps (figure A).
- Insérez soigneusement l'électrode dans M6 et regarder pour hyperpolarisation rapide. Muscle potentiels de membrane de repos doit être partout de -30 mV à -70 mV.
- Ajuster la lumière bleue de telle sorte que de préparation disséquée est centré dans faisceau de lumière.
- Donner des impulsions de tension de 20 à 100 ms pour le circuit de contrôle. Accroître progressivement la tension fournie au circuit de commande. Surveillez les potentiels de jonction excitateurs dans la cellule musculaire (figure 1B).
Les résultats représentatifs:
La figure 1A montre un schéma de la configuration de l'enregistrement et la préparation de filets. Figure 1B montre EJP typiques évoquées par impulsions lumineuses courtes. L'amplitude EJP montré l'amplitude est résumée par deux neurones moteurs connus à la fois innervent M6. Intensités de lumière Basse activé seulement une unité de moteur (données non présentées).
Figure 1: Un schéma) d'une plate-forme générale d'enregistrement intracellulaire et avec LED bleue. Cerveau (Br) est supprimée pour inhiber l'activité rythmique dans le ganglion ventral (VG). CHR2 est exprimée dans les neurones moteurs en utilisant le système GAL4-UAS. B) l'enregistrement intracellulaire d'un muscle M6. 40 ms des impulsions de lumière bleue (à 127 uW / mm 2) évoquent de manière fiable grands potentiels synaptiques (astérisques) à M6.
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Discussion
Les étapes critiques impliquent à la fois la dissection initiale et l'entrée des cellules musculaires. Si les nerfs sont coupés ou muscle est endommagé lors de la dissection initiale, il est difficile de continuer le reste de l'expérience. Pendant la dissection, il faut être très prudent à l'angle de disséquer des ciseaux à la hausse autant que possible lors de l'incision dorsale. Durant la deuxième étape cruciale, entrer dans une cellule musculaire, il faut regarder pour un hyperpolarisation dernières ~ 30 mV. Les valeurs supérieures à -30 mV indiquent que l'électrode est soit pas correctement dans une cellule musculaire ou dans une cellule insalubre.
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Disclosures
Nous n'avons aucun conflit d'intérêt à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de subventions de la santé RO1GM-33205 et MH-067284 à LC Griffith et par une bourse de Brandeis Université d'été de recherche de premier cycle à NJ Hornstein. Des expériences préliminaires de cette technique ont été réalisées au Laboratoire de biologie marine dans le cadre de l'édition 2008 des systèmes neuronaux et cours d'été de comportement (NIMH subvention: R25 MH059472) à Woods Hole, MA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | 4019862 | www.ellsworth.com |
| Minutens Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | www.finescience.com |
| Dissecting Dish | Fisher Scientific | www.fishersci.com | |
| Neuroprobe Intracellular Amplifier and Head Stage | A-M Systems | 680100 | www.a-msystems.com |
| Powerlab 4/30 data acquisition system |  ADInstruments |
www.adinstruments.com | |
| Grass stimulator | Grass Technologies | www.grasstechnologies.com | |
| Desktop Computer | Dell | www.dell.com | |
| Dissecting Scope | Leica Microsystems | www.leica-microsystems.com | |
| Light Source | Dolan-Jenner Industries | 41446-062 | www.dolan-jenner.com |
| Fly Media | |||
| All-Trans-Retinal | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | www.sigmaaldrich.com |
| OK-371 Gal4 Flies | Bloomington Stock center | ||
| UAS-ChR2 Flies | Fiala lab, Griffith lab | ||
| LED controller circuit | Built in Griffith lab | http://www.ledsupply.com http://www.futureelectronics.com Composed of: 1. 200 mA Buck Puck 2. Blue LED 3. Insulated wire 4. Circuit bread board |
|
| LED Heat Sink | Thorlabs Inc. | http://www.thorlabs.com/ | |
| Air Table | TMC | http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html | |
| Faraday Cage | Built in Griffith lab | ||
| Leica Leitz M Micro-Manipulator | Leica Microsystems | ACS01 | www.leica-microsystems.com |
| Electrode Holder | Axon Instruments | www.axon.com | |
| Borosilicate Glass | FHC, Inc. | www.fh-co.com/p14-15.pdf | |
| Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | www.sutter.com | |
| HL 3.1 Saline with 0.8mM Ca2+ | Contents (mM): NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8 MgCl2:4Sucrose:115 NaHCO3: 10 Trehalose: 5 HEPES |
||
| Micro-Dissection Tools | Fine Science Tools | www.finescience.com |
References
- Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35 (2007).
- Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72 (2007).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940 (2003).
- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741 (2006).
- Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers. Neuron. 14 (4), 707 (1995).
- Ralph Greenspan, Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).
