Summary
Bei diesem Verfahren wird ein blaues Licht aktiviert Algen Kanal-und Zell-spezifische genetische Expression Tools zur synaptischen Potentiale mit Lichtimpulsen evozieren an der neuromuskulären Synapse (NMJ) in
Abstract
Die
Protocol
Teil 1: Tierpflege und genetische Kreuze
- Pflegen Sie UAS-ChR2 und OK371-GAL4 fliegen in getrennten Flaschen mit Standard-fly media 8.
- Sammeln Jungfrauen OK371-GAL4 fliegen Linien und Männchen UAS-ChR2 Linien.
- Legen Sie beide Männchen und Weibchen in einem Fläschchen mit Standard-fly-Medien mit 1 mM all-trans-Retinal (ATR) gemischt. ATR Nahrung sollte vorher zu schmelzen regelmäßig fliegen Medien in der Mikrowelle für ca. 1 Minute erfolgen. Sobald geschmolzen, damit für etwa 30 Sekunden bis 1 Minute abkühlen lassen und dann mit 100 ul 100 mM ATR in 100% EtOH für je 10 ml fly Medien. Legen Fläschchen auf dem Eis, dann in einem dunklen Raum lagern bei 4 ° C.
- Lassen Sie fliegt paaren und Eier legen in einem dunklen Raum bei 22-25 ° C.
- Warten Sie 3-4 Tage bis zum 3. Larvenstadium sichtbar sind; an diesem Punkt, der erwachsenen Fliegen zu entsorgen.
Teil 2: Rig Setup
- Fügen Sie alle 10x Binokular Okular (in unserem Fall, von Carl Zeiss Inc., www.zeiss.com, Thornwood, NY), um blaue LED-Lichtquelle mit Kühlkörper (Thor Labs, www.thorlabs.com, Newton, NJ ). Attach to Magnetfuß mit post und klemmen. Abdeckung Kühlkörper mit einem elektrisch geerdeten Abschirmung gegen elektrisches Rauschen von der Lichtquelle erzeugte reduzieren.
- Legen Sie Magnetfuß mit Lichtquelle auf Lufttisch der Elektrophysiologie rig.
- Connect Lichtquelle an den Steuerkreis und verbinden Regelkreis auf externe Spannungsquelle (Powerlab 4 / 30, ADInstruments, www.adinstruments.com, Colorado Springs, CO).
- Geben Sie 1-5 V Impulse an den Steuerkreis, um blaues Licht zu aktivieren.
- Passen Magnetfuß und Lichtquelle, bis blauen Lichtstrahl auf einer Fläche von Larven Dissektion besetzt werden konzentriert.
Teil 3: Dissection
- Stecken Sie sechs 0,1 mm Insektennadeln in den Boden eines Sylgard gesäumten Gericht.
- Entfernen Sie einen 3 rd Larvenstadium aus der Nahrung Medien aufnehmen und in eine plastische Petri-Schale.
- Spülen Larven mit Kochsalzlösung auf Nahrung zu entfernen.
- Legen Larven in Sezieren Gericht in der Nähe des gezogen Stifte und fügen Kochsalzlösung ½ Ebene.
- Orient die Larven, so dass Sie zwei silberne Röhren (Tracheen), die entlang des Tieres dorsalen Oberfläche sehen können.
- Legen Sie eine grosse Nadel direkt in den Schwanz zwischen die Trachealtuben. Halten Sie die Larven ab und legen Sie eine zweite große Nadel in den Kopf, sicher zu sein, um den Körper ausstrecken Längsrichtung.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Nähe des Schwanzes, und weiterhin ist die Länge des Körpers. Stellen Sie sicher, dass die Spitzen der Schere so sind, wie nicht versehentlich geschnitten ventralen Nerven und / oder Körper Wand Muskeln erhöht.
- Legen Sie vier Pins an den vier Ecken des Tieres ist jetzt offen Mittelteil. Setzen Sie diese in das Sezieren Gericht so Filet des Tieres. Pin Zubereitung vermittelt.
- Mit einer Pinzette und Schere, entfernen Sie das Tier guts, der Luftröhre und Fettkörper.
- Spülen Sie die Vorbereitung mit Kochsalzlösung.
- Suchen Sie den Frontallappen (wie in Abb. A aus gesehen) und Bauchganglion des prep.
- Mit Mikro-Schere, schneiden Sie vorsichtig durch die Bauchganglion direkt hinter dem Frontallappen.
Teil 4: Muscle Aufnahme und blaues Licht Stimulation
- Ziehen Sie eine 10-20 μω Elektrode mittels eines elektronischen Elektrode Puller (Sutter Instruments).
- Füllen Sie die Elektrode gezogen mit 3 M KCl.
- Gefüllte Elektrode in Elektrodenhalter und Manöver Elektrodenspitze mit einem Mikromanipulator in der Nähe Larven prep unter Binokular auf Elektrophysiologie rig.
- Identifizieren Muscle 6 (M6) in jede Einrichtung Wandsegment (Abb. A).
- Vorsichtig Elektrode in M6 und achten Sie auf eine schnelle Hyperpolarisation. Muscle Ruhe Membranpotentiale sollte irgendwo zwischen -30 mV bis -70 mV.
- Passen blaues Licht, so dass seziert prep in Lichtstrahl zentriert ist.
- Geben 20-100 ms Spannungsimpulse an den Steuerkreis. Schrittweise zu erhöhen versorgt an den Steuerkreis. Achten Sie auf exzitatorische Kreuzung Potenziale in der Muskelzelle (Abbildung 1B).
Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung der Aufnahme-Setup und filetiert Vorbereitung. Abbildung 1B zeigt typische EJP durch kurze Lichtpulse hervorgerufen. EJP Amplitude dargestellt wird Amplitude von zwei motorischen Neuronen bekannt, sowohl innervieren M6 summiert. Geringere Lichtintensitäten nur ein Motor-Einheit (Daten nicht gezeigt) aktiviert.
Abbildung 1: A) Allgemeines Schema eines intrazellulären Aufnahme rig und mit blauen LED. Brain (Br) wird entfernt, um rhythmische Aktivität im ventralen Ganglion (VG) zu hemmen. ChR2 ist in Motoneuronen mit der GAL4-UAS-System ausgedrückt. B) Intrazelluläre Aufnahme von einem M6 Muskel. 40 ms blaue Lichtblitze (bei 127 mW / mm 2) zuverlässig wecken große synaptischen Potentiale (Sternchen) in M6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische Schritte umfassen sowohl die ursprüngliche Dissektion und das Eintreten von Muskelzellen. Wenn die Nerven abgeschnitten werden oder Muskel beschädigt ist während der ersten Sektion ist es schwierig, den Rest das Experiment fortzusetzen. Während Dissektion, muss man sehr vorsichtig sein, um Winkel Präparierscheren nach oben so viel wie möglich während der dorsale Inzision. Während der zweite entscheidende Schritt in eine Muskelzelle, muss man für eine Hyperpolarisation letzten ~ 30 mV zu beobachten. Werte über -30 mV zeigen, dass die Elektrode entweder nicht richtig in einer Muskelzelle oder in eine ungesunde Zelle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wir haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewährt RO1GM-33205 und MH-067284 zu LC Griffith und durch eine Brandeis University Sommer Undergraduate Research Stipendium NJ Hornstein unterstützt. In Woods Hole, MA: Erste Experimente für diese Technik wurden am Marine Biological Laboratory im Rahmen des 2008 Neural Systems and Behavior Sommerkurs (R25 MH059472 NIMH Zuschuss) durchgeführt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | 4019862 | www.ellsworth.com |
| Minutens Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | www.finescience.com |
| Dissecting Dish | Fisher Scientific | www.fishersci.com | |
| Neuroprobe Intracellular Amplifier and Head Stage | A-M Systems | 680100 | www.a-msystems.com |
| Powerlab 4/30 data acquisition system |  ADInstruments |
www.adinstruments.com | |
| Grass stimulator | Grass Technologies | www.grasstechnologies.com | |
| Desktop Computer | Dell | www.dell.com | |
| Dissecting Scope | Leica Microsystems | www.leica-microsystems.com | |
| Light Source | Dolan-Jenner Industries | 41446-062 | www.dolan-jenner.com |
| Fly Media | |||
| All-Trans-Retinal | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | www.sigmaaldrich.com |
| OK-371 Gal4 Flies | Bloomington Stock center | ||
| UAS-ChR2 Flies | Fiala lab, Griffith lab | ||
| LED controller circuit | Built in Griffith lab | http://www.ledsupply.com http://www.futureelectronics.com Composed of: 1. 200 mA Buck Puck 2. Blue LED 3. Insulated wire 4. Circuit bread board |
|
| LED Heat Sink | Thorlabs Inc. | http://www.thorlabs.com/ | |
| Air Table | TMC | http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html | |
| Faraday Cage | Built in Griffith lab | ||
| Leica Leitz M Micro-Manipulator | Leica Microsystems | ACS01 | www.leica-microsystems.com |
| Electrode Holder | Axon Instruments | www.axon.com | |
| Borosilicate Glass | FHC, Inc. | www.fh-co.com/p14-15.pdf | |
| Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | www.sutter.com | |
| HL 3.1 Saline with 0.8mM Ca2+ | Contents (mM): NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8 MgCl2:4Sucrose:115 NaHCO3: 10 Trehalose: 5 HEPES |
||
| Micro-Dissection Tools | Fine Science Tools | www.finescience.com |
References
- Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35 (2007).
- Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72 (2007).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940 (2003).
- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741 (2006).
- Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers. Neuron. 14 (4), 707 (1995).
- Ralph Greenspan, Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).
