Summary
Bu prosedür sinaptik potansiyeller, nöromüsküler bileşke (NMJ) ışık darbeleri ile uyandırmak için mavi bir ışık ile aktive alg kanal ve hücre spesifik genetik ifade araçları kullanır
Abstract
Protocol
Bölüm 1: Hayvan bakım ve genetik haçlar
- UAS-ChR2 ve standart sinek medya içeren 8 ayrı şişelerde OK371-GAL4 sinek hattı koruyun.
- OK371-GAL4 sinek hatları ve UAS-ChR2 hatlar erkekler bakireler toplayın.
- Kadın ve erkeklerde 1 mM all-trans retina (ATR) ile karışık standart sinek medya içeren bir şişe yerleştirin. ATR gıda ~ 1 dakika için mikrodalga ilk erime düzenli sinek medya tarafından yapılmalıdır. Erimiş sonra, bir dakika 30 saniye için serin ve daha sonra 100 mM sinek medya her 10 ml için% 100 ETOH ATR 100 ul eklemek için izin verir. Buz üzerine yerleştirin şişeleri, sonra 4 karanlık bir alanda saklamak ° C
- Let sinekler arkadaşı ve karanlık bir alanda yumurta 22-25 ° C yatıyordu
- 3. instar larva görünür olana kadar 3-4 gün bekleyin, bu noktada, yetişkin sinekler atmayın.
Bölüm 2: Rig kurulum
- Mavi LED herhangi bir 10x diseksiyon kapsamı göz parçası (bizim durumumuzda, Carl Zeiss Inc www.zeiss.com, Thornwood, NY), soğutucu ışık kaynağı (Thor laboratuarları, www.thorlabs.com, Newton, NJ takın .) Mesaj ve kelepçe ile manyetik taban takın. Işık kaynağı tarafından üretilen elektrik gürültüsünü azaltmak için bir elektrik topraklı kalkan soğutucu örtün.
- Elektrofizyoloji teçhizat hava masaya ışık kaynağı ile yer manyetik taban.
- Devre kontrolü ve dış gerilim kaynağı (Powerlab 4 / 30, ADInstruments www.adinstruments.com, Colorado Springs, CO) kontrol devresi bağlamak için ışık kaynağı bağlayın.
- Mavi ışık etkinleştirmek için devre kontrol etmek için 1-5 V bakliyat verin.
- Manyetik taban ve ışık kaynağı, mavi ışık demeti larva diseksiyon tarafından işgal edilecek alana odaklanmış kadar ayarlayın.
Bölüm 3: Diseksiyon
- Sylgard astarlı çanak zemine yerleştirin altı 0,1 mm böcek pimleri.
- Herhangi bir plastik Petri yemek yiyecek medya ve yerden bir 3. instar larvaları çıkarın.
- Larvaları gıda çıkarmak için tuzlu su ile durulayın.
- Place çekti pimleri yakın çanak diseksiyon larva ve ½ düzeyde tuzlu su ekleyin.
- Orient hayvanın sırt yüzeyi boyunca çalışan iki gümüş tüpleri (trakea), böylece larvaları.
- Trakeal tüpler arasındaki kuyruk doğrudan büyük bir iğne takın. Larvaları basılı tutun ve başını içine ikinci büyük bir piminin vücut boyuna uzatmak için emin olmak.
- Kuyruk yakınlarındaki küçük bir kesi yapmak ve vücut uzunluğu kadar devam edin. Yanlışlıkla ventral sinirler ve / veya vücut duvarı kasları kesmek için makas ipuçları yetiştirilir emin olun.
- Dört iğneli hayvanın dört köşesine yerleştirin artık açık Midsection bulunuyor. Fileto hayvan şekilde diseksiyon çanak içine ayarlayın. Pin hazırlık dışarı öğretti.
- Forseps ve makas kullanılarak, hayvanın bağırsaklar, trakea ve yağ organları çıkarın.
- Hazırlık tuzlu su ile durulayın.
- Frontal loblar (Şekil A'da görüldüğü gibi) ve hazırlık ventral ganglion bulun.
- Mikro-makas kullanarak, dikkatli bir şekilde sadece frontal loblar arkasında ventral ganglion kesti.
Bölüm 4: Kas kayıt ve mavi ışık stimülasyonu
- Elektronik bir elektrot çektirmesi (Sutter Araçlar) kullanarak 10-20 μω elektrot çekin.
- 3 M KCl ile çekilmiş elektrot doldurun.
- Place elektrofizyoloji teçhizat diseksiyon mikroskobu altında larva hazırlık yakın bir mikromanipülatör ile elektrod, elektrot tutucu ve manevra elektrot ucu doldurdu.
- Vücudun herhangi bir duvar parçasının (Şekil A) Kas 6 (M6) belirleyin.
- M6 içine dikkatlice elektrodu takın ve hızlı bir şekilde hiperpolarizasyon izlemek. Kas istirahat membran potansiyelleri -30 mV -70 mV herhangi bir yerde olmalıdır.
- Mavi ışık, ışık demeti disseke hazırlık merkezli şekilde ayarlayın.
- Devre kontrolü için 20-100 ms voltaj darbeleri verin. Adım adım devre kontrolü sağlanan gerilimi artırmak. Kas hücresi (Şekil 1B) eksitatör kavşak potansiyelleri dikkat edin.
Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1A kayıt kurulum ve fileto hazırlanması şematik gösterir. Şekil 1B kısa ışık darbeleri ile uyarılmış tipik EJP gösterir. Gösterilen EJP genlik innerve M6 hem bilinen iki motor nöronların genlik toplanır. Düşük ışık şiddetlerinde bir motor ünitesi (veriler gösterilmemiştir) sadece aktif.
Şekil 1: A) intraselüler bir kayıt teçhizat ve mavi LED ile Genel şematik. Brain (Br), ventral ganglion (VG) ritmik aktivitesini inhibe kaldırılır. ChR2 GAL4 UAS sistemini kullanarak motor nöronların ifade edilir. M6 kas B) Hücre içi kayıt. 40 ms mavi ışık darbeleri (127 μW / mm 2) güvenilir M6 büyük sinaptik potansiyeller (yıldız) çağrıştırıyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritik adımlar ilk diseksiyon ve kas hücrelerine girişini içerir. Ilk diseksiyon sırasında sinirler kesilir veya kas bozuksa bu deney geri kalanı devam etmek zordur. Diseksiyon sırasında, bir dorsal insizyon sırasında yukarı doğru mümkün olduğunca makas diseksiyon açısını çok dikkatli olmalıdır. Ikinci önemli adım sırasında, bir kas hücreye girerek, bir geçmişte bir hiperpolarizasyon ~ 30 mV için dikkat etmeniz gerekir. -30 MV Yukarıdaki değerler, elektrot, bir kas hücre içinde ya da sağlıksız bir hücreye doğru ya da değil olduğunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa etmek için hiçbir çıkar çatışmaları var.
Acknowledgments
Bu çalışma, Sağlık hibe RO1GM-33205 ve MH-067.284 LC Griffith Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından ve Brandeis Üniversitesi NJ Hornstein yaz lisans araştırma bursu tarafından desteklenmiştir. Woods Hole, MA: 2008 Sinir Sistemleri ve Davranış yaz kursu (R25 MH059472 NIMH hibe) bir parçası olarak bu tekniği için ön deneyler Deniz Biyoloji Laboratuvarı yapıldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | 4019862 | www.ellsworth.com |
| Minutens Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | www.finescience.com |
| Dissecting Dish | Fisher Scientific | www.fishersci.com | |
| Neuroprobe Intracellular Amplifier and Head Stage | A-M Systems | 680100 | www.a-msystems.com |
| Powerlab 4/30 data acquisition system |  ADInstruments |
www.adinstruments.com | |
| Grass stimulator | Grass Technologies | www.grasstechnologies.com | |
| Desktop Computer | Dell | www.dell.com | |
| Dissecting Scope | Leica Microsystems | www.leica-microsystems.com | |
| Light Source | Dolan-Jenner Industries | 41446-062 | www.dolan-jenner.com |
| Fly Media | |||
| All-Trans-Retinal | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | www.sigmaaldrich.com |
| OK-371 Gal4 Flies | Bloomington Stock center | ||
| UAS-ChR2 Flies | Fiala lab, Griffith lab | ||
| LED controller circuit | Built in Griffith lab | http://www.ledsupply.com http://www.futureelectronics.com Composed of: 1. 200 mA Buck Puck 2. Blue LED 3. Insulated wire 4. Circuit bread board |
|
| LED Heat Sink | Thorlabs Inc. | http://www.thorlabs.com/ | |
| Air Table | TMC | http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html | |
| Faraday Cage | Built in Griffith lab | ||
| Leica Leitz M Micro-Manipulator | Leica Microsystems | ACS01 | www.leica-microsystems.com |
| Electrode Holder | Axon Instruments | www.axon.com | |
| Borosilicate Glass | FHC, Inc. | www.fh-co.com/p14-15.pdf | |
| Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | www.sutter.com | |
| HL 3.1 Saline with 0.8mM Ca2+ | Contents (mM): NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8 MgCl2:4Sucrose:115 NaHCO3: 10 Trehalose: 5 HEPES |
||
| Micro-Dissection Tools | Fine Science Tools | www.finescience.com |
References
- Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35 (2007).
- Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72 (2007).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940 (2003).
- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741 (2006).
- Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers. Neuron. 14 (4), 707 (1995).
- Ralph Greenspan, Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).
