Summary
यह प्रक्रिया एक नीले प्रकाश सक्रिय algal चैनल और सेल विशिष्ट आनुवंशिक अभिव्यक्ति उपकरण का उपयोग करता है प्रकाश दालों के साथ neuromuscular जंक्शन (NMJ) पर synaptic क्षमता आह्वान
Abstract
Protocol
भाग 1: पशु देखभाल और आनुवंशिक पार
- यूएएस - ChR2 और OK371 - अलग मानक मक्खी मीडिया 8 युक्त बोतलों में GAL4 उड़ लाइनों को बनाए रखें .
- OK371 GAL4 उड़ लाइनों और यूएएस - ChR2 लाइनों के पुरुषों की कुंवारी ले लीजिए .
- दोनों पुरुषों और महिलाओं को एक मानक मक्खी 1 मिमी सभी ट्रांस रेटिना (एटीआर) के साथ मिश्रित मीडिया युक्त शीशी में रखो. एटीआर खाना ~ 1 मिनट के लिए माइक्रोवेव में पहली पिघलने नियमित रूप से मक्खी मीडिया द्वारा किया जाना चाहिए. एक बार पिघला, के बारे में 30 सेकंड के लिए एक मिनट के लिए शांत और फिर जोड़ने के 100 मिमी मक्खी मीडिया के हर 10 मिलीलीटर के लिए 100% ETOH में एटीआर के 100 μl अनुमति देते हैं. बर्फ पर प्लेस शीशियों, तो 4 बजे एक अंधेरे क्षेत्र में दुकान डिग्री सेल्सियस
- मक्खियों दोस्त चलो और एक अंधेरे क्षेत्र में 22-25 अंडे ° सी. करना
- 3-4 दिन रुको जब तक 3 instar लार्वा दिखाई दे रहे हैं, उस बिंदु पर, वयस्क मक्खियों के निपटान.
भाग 2: रिग सेटअप
- किसी भी 10x विदारक गुंजाइश आंख (हमारे मामले में, कार्ल Zeiss इंक www.zeiss.com, Thornwood, NY से) टुकड़ा है, गर्मी सिंक के साथ नीले एलईडी प्रकाश स्रोत (थोर प्रयोगशालाओं, www.thorlabs.com, न्यूटन, न्यू जर्सी संलग्न ). पोस्ट और घोड़े का अंसबंध के साथ चुंबकीय आधार करने के लिए संलग्न. एक विद्युत पर आधारित के लिए बिजली के प्रकाश स्रोत द्वारा उत्पन्न शोर को कम ढाल के साथ गर्मी सिंक कवर.
- प्लेस इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग के लिए हवा की मेज पर प्रकाश स्रोत के साथ चुंबकीय आधार.
- सर्किट नियंत्रण और बाहरी वोल्टेज स्रोत (Powerlab 4 / 30, ADInstruments, www.adinstruments.com, कोलोराडो स्प्रिंग्स, सीओ) नियंत्रण परिपथ कनेक्ट प्रकाश स्रोत कनेक्ट.
- सर्किट को नियंत्रित करने के लिए नीले प्रकाश को सक्रिय 1-5 वी दालों दे.
- चुंबकीय आधार और प्रकाश स्रोत है जब तक नीले प्रकाश बीम लार्वा विच्छेदन के द्वारा कब्जा किया जा क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित है समायोजित.
भाग 3: विच्छेदन
- प्लेस sylgard लाइन एक डिश के तल में छह 0.1 मिमी कीट पिन.
- प्लास्टिक किसी भी पेट्री डिश में भोजन मीडिया और जगह से 3 Rd instar लार्वा निकालें.
- खारा के लिए भोजन को दूर के साथ लार्वा कुल्ला.
- खींच पिन के पास पकवान विदारक में प्लेस लार्वा और साढ़े स्तर पर खारा जोड़ने.
- ओरिएंट लार्वा इतनी है कि आप दो चांदी (ट्रेकिआ) ट्यूबों जानवर पृष्ठीय सतह के साथ चल रहा है देख सकते हैं.
- एक बड़े पिन tracheal ट्यूबों के बीच में पूंछ में सीधे सम्मिलित करें. लार्वा को दबाए रखें और अपने सिर में एक दूसरे बड़े पिन जगह, शरीर खिंचाव बाहर लंबाई सुनिश्चित किया जा रहा है.
- पूंछ के पास एक छोटा सा चीरा करें, और यह जारी रखने के शरीर की लंबाई. सुनिश्चित करें कि कैंची के सुझावों तो उठा रहे हैं उदर नसों और / या शरीर दीवार मांसपेशियों के रूप में गलती से कटौती नहीं.
- जानवर के चार कोनों पर चार पिन प्लेस अब खुला midsection है. उन्हें विदारक डिश में इतनी के रूप में सेट जानवर पट्टिका. पिन तैयारी बाहर सिखाया.
- संदंश और कैंची का प्रयोग, पशु हिम्मत, ट्रेकिआ और वसा शरीर को हटा दें.
- नमक के साथ प्रस्तुत करने का कुल्ला.
- ललाट lobes (के रूप में एक छवि में देखा) और प्रस्तुत करने के उदर नाड़ीग्रन्थि पता लगाएँ.
- माइक्रो कैंची का प्रयोग, ध्यान से ललाट lobes के पीछे उदर नाड़ीग्रन्थि के माध्यम से कटौती.
भाग 4: बलवान रिकॉर्डिंग और नीले प्रकाश उत्तेजना
- एक 10-20 μω एक इलेक्ट्रॉनिक इलेक्ट्रोड खींचने (Sutter उपकरण) का उपयोग कर इलेक्ट्रोड खींचो.
- एम 3 KCl के साथ खींच लिया इलेक्ट्रोड भरें.
- प्लेस इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग पर विदारक माइक्रोस्कोप के तहत प्रस्तुत करने का लार्वा के पास एक micromanipulator के साथ इलेक्ट्रोड धारक और पैंतरेबाज़ी इलेक्ट्रोड टिप में इलेक्ट्रोड भरा.
- शरीर के किसी भी दीवार खंड (चित्र एक) में 6 बलवान (M6) को पहचानें.
- ध्यान से M6 में इलेक्ट्रोड डालने और तेजी hyperpolarization के लिए घड़ी. स्नायु आराम झिल्ली क्षमता कहीं -30 mV से -70 एम वी होना चाहिए.
- नीले प्रकाश को समायोजित इतना है कि dissected प्रस्तुत करने बीम प्रकाश में केंद्रित है.
- सर्किट नियंत्रण 20-100 एमएस वोल्टेज दालों दे. संवर्द्धित सर्किट नियंत्रण के लिए आपूर्ति वोल्टेज वृद्धि हुई है. मांसपेशी कोशिका (चित्रा 1 बी) में उत्तेजक जंक्शन क्षमता के लिए देखो.
प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1A रिकॉर्डिंग सेटअप और filleted तैयारी के एक योजनाबद्ध दिखाता है. चित्रा 1 बी ठेठ कम प्रकाश दालों के द्वारा पैदा की EJP से पता चलता है. EJP दिखाया आयाम दो मोटर न्यूरॉन्स से दोनों M6 अंदर आना करने के लिए जाना जाता आयाम अभिव्यक्त किया है. कम प्रकाश तीव्रता केवल एक मोटर इकाई (नहीं दिखाया डेटा है) को सक्रिय.
चित्रा 1: एक) एक intracellular रिकॉर्डिंग रिग और नीले एलईडी के साथ जनरल योजनाबद्ध . ब्रेन (Br) उदर नाड़ीग्रन्थि (VG) में लयबद्ध गतिविधि को बाधित करने के लिए हटा दिया है. ChR2 GAL4 - यूएएस प्रणाली का उपयोग मोटर न्यूरॉन्स में व्यक्त की है. बी) एक M6 पेशी से intracellular रिकॉर्डिंग. 40 एमएस नीले प्रकाश दालों (127 2 / μW मिमी) मज़बूती M6 में बड़े synaptic क्षमता (तारांकनों) आह्वान.
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Discussion
गंभीर कदम दोनों प्रारंभिक विच्छेदन और मांसपेशियों की कोशिकाओं के प्रवेश शामिल है. यदि नसों में कटौती कर रहे हैं या प्रारंभिक विच्छेदन के दौरान मांसपेशियों क्षतिग्रस्त है यह मुश्किल है कि जारी रखने के लिए प्रयोग के बाकी है. विच्छेदन के दौरान, एक बहुत पृष्ठीय चीरा के दौरान ऊपर की तरफ के रूप में जितना संभव हो कैंची विदारक कोण करने के लिए सावधान रहना चाहिए. दूसरा महत्वपूर्ण कदम के दौरान, एक मांसपेशी कोशिका में प्रवेश, एक पिछले hyperpolarization ~ 30 एम वी के लिए देखना चाहिए. -30 MV ऊपर मान का संकेत मिलता है कि इलेक्ट्रोड एक मांसपेशी कोशिका के भीतर या एक अस्वास्थ्यकर कक्ष में या तो ठीक नहीं है.
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Disclosures
हम ब्याज की कोई संघर्ष का खुलासा है.
Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य RO1GM 33,205 अनुदान और महाराष्ट्र 067,284 नियंत्रण रेखा ग्रिफ़िथ संस्थानों और ब्राण्डैस विश्वविद्यालय गर्मियों स्नातक अनुसंधान न्यू जर्सी Hornstein छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया. वुड्स होल, एमए में: इस तकनीक के लिए प्रारंभिक प्रयोगों 2008 तंत्रिका सिस्टम और व्यवहार गर्मियों (MH059472 R25 NIMH अनुदान) पाठ्यक्रम के हिस्से के रूप में समुद्री जैव प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | 4019862 | www.ellsworth.com |
| Minutens Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | www.finescience.com |
| Dissecting Dish | Fisher Scientific | www.fishersci.com | |
| Neuroprobe Intracellular Amplifier and Head Stage | A-M Systems | 680100 | www.a-msystems.com |
| Powerlab 4/30 data acquisition system |  ADInstruments |
www.adinstruments.com | |
| Grass stimulator | Grass Technologies | www.grasstechnologies.com | |
| Desktop Computer | Dell | www.dell.com | |
| Dissecting Scope | Leica Microsystems | www.leica-microsystems.com | |
| Light Source | Dolan-Jenner Industries | 41446-062 | www.dolan-jenner.com |
| Fly Media | |||
| All-Trans-Retinal | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | www.sigmaaldrich.com |
| OK-371 Gal4 Flies | Bloomington Stock center | ||
| UAS-ChR2 Flies | Fiala lab, Griffith lab | ||
| LED controller circuit | Built in Griffith lab | http://www.ledsupply.com http://www.futureelectronics.com Composed of: 1. 200 mA Buck Puck 2. Blue LED 3. Insulated wire 4. Circuit bread board |
|
| LED Heat Sink | Thorlabs Inc. | http://www.thorlabs.com/ | |
| Air Table | TMC | http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html | |
| Faraday Cage | Built in Griffith lab | ||
| Leica Leitz M Micro-Manipulator | Leica Microsystems | ACS01 | www.leica-microsystems.com |
| Electrode Holder | Axon Instruments | www.axon.com | |
| Borosilicate Glass | FHC, Inc. | www.fh-co.com/p14-15.pdf | |
| Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | www.sutter.com | |
| HL 3.1 Saline with 0.8mM Ca2+ | Contents (mM): NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8 MgCl2:4Sucrose:115 NaHCO3: 10 Trehalose: 5 HEPES |
||
| Micro-Dissection Tools | Fine Science Tools | www.finescience.com |
References
- Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35 (2007).
- Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72 (2007).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940 (2003).
- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741 (2006).
- Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers. Neuron. 14 (4), 707 (1995).
- Ralph Greenspan, Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).
