Живая клетка изображений имеет особую полезность при изучении динамики торговли органелл. Здесь мы опишем протокол для живого изображения плотных процессоров пузырьки в культуре нейронов использованием широкого поля флуоресцентной микроскопии. Этот протокол является гибкой и может быть адаптирована для изображения других органелл типа митохондрий, эндосомы и пероксисом.
Abstract
Наблюдение и характеризующих динамическую клеточных процессов может дать важную информацию о клеточной активности, которые не могут быть получены из статических изображений. Vital флуоресцентных зондов, особенно зеленый флуоресцентный белок (GFP) произвели революцию клеточной биологии, вытекающих из способности этикетке конкретного внутриклеточные отсеки и клеточных структур. Например, жить изображений GFP (и его спектральный варианты) химерами позволили динамического анализа цитоскелета, органелл транспорта и мембраны динамика во множестве организмов и типов клеток [1-3]. Хотя жить изображений стала распространенной, этот подход до сих пор вызывает много технических проблем, особенно в начальной культурный нейронов. Одной из проблем является выражением GFP с метками белков в пост-митотического нейроны, а другая возможность захвата флуоресцентные изображения при минимальном фототоксичности, фотообесцвечивания, а также поддержание общего здоровья клеток. Здесь мы предлагаем протокол, который описывает на основе липидов трансфекции метод, который дает относительно низкий уровень трансфекции (~ 0,5%), однако идеально подходит для визуализации полностью поляризованных нейронов. Низкий уровень трансфекции важно, чтобы один аксонов и дендритов может быть охарактеризована как их ориентации в тело клетки, чтобы подтвердить направленность транспорта, т.е., антероградная против ретроградной. Наш подход к визуализации GFP выражения нейронов зависит от стандартного широкого поля флуоресцентный микроскоп оснащен ПЗС-камеры, программное обеспечение захвата изображения, а также подогревом камеры изображений. Мы отображаемого разнообразных органелл или сооружений, например, плотной основной пузырьков, митохондрий, конусы роста, и актин без каких-либо специальной оптики или возбуждения условий, отличных от флуоресцентных источников света. Кроме того, спектрально-различны, флуоресцентно меченых белков, например, GFP и DsRed с метками белки, могут быть визуализированы возле одновременно для характеристики со-транспортных и иных скоординированных клеточных событий. Изображения Описанный здесь подход является гибким для различных приложений и изображения могут быть приняты лаборатории при относительно небольших затратах при условии, микроскоп доступен.
Protocol
Часть 1: Трансфекция нейронов использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen) Оборудование установки: Крыса или мышь нейронов гиппокампа культивируются в соответствии с Kaech и банкир, 2006 [4]. Типичная плотность клеток используется для трансфекции является 250000 cells/6-cm блюдо. О?…
Discussion
Живая визуализации ячейки сложным, но мощная техника для прямого наблюдения органелл транспорта в культуре нейронов. Трудности могут возникнуть перед процедурой с плохим нейрона здоровья из-за культуры осложнений. Таким образом, клетка здоровье (примеры см. ссылка 4) должны быть оцене?…
Acknowledgements
Мы благодарим Харальд Хуттер и Елена Decker для их внимательного прочтения этой рукописи. Мы также благодарим Reg Сидху из Leica Microsystems для своих технических знаний. Это исследование было поддержано Национальным наук и инженерного совета Канады, премия # 327100-06, и Simon Fraser University Факультет естественных наук.
Kwinter, D. M., Silverman, M. A. Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (27), e1144, doi:10.3791/1144 (2009).