Summary

הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בתוך ראשי נוירונים בהיפוקמפוס Cultured

Published: May 29, 2009
doi:

Summary

הדמיה תא חי היא של כלי מסוים כאשר לומדים את הדינמיקה של סחר אברון. כאן אנו מתארים פרוטוקול הדמיה חיה של צפופה ליבות שלפוחית ​​בנוירונים בתרבית שימוש רחב בתחום מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פרוטוקול זה הוא גמיש ניתן להתאים האברונים תמונה אחרים כגון המיטוכונדריה, endosomes, ואת peroxisomes.

Abstract

התבוננות ואפיון תהליכים תאיים דינמי יכולה להניב מידע חשוב על פעילות הסלולר שלא ניתן שנרכשו תמונות סטטיות. בדיקות ניאון ויטל, חלבון פלואורסצנטי ירוק במיוחד (GFP) חוללו מהפכה בביולוגיה של התא הנובע היכולת לתייג תאים תאיים מסוימים ומבנים הסלולר. כך, למשל, הדמיה חיה של ה-GFP (וגירסאות ספקטרלי שלה) מפלצות אפשרו לניתוח דינמי של cytoskeleton, תחבורה אברון, ואת הדינמיקה קרום שפע של אורגניזמים סוגי תאים [1-3]. למרות הדמיה חיים הפך להיות שכיח, גישה זו עדיין מציבה אתגרים טכניים רבים, בעיקר נוירונים בתרבית ראשונית. אתגר אחד הוא ביטוי של GFP-tagged חלבונים שלאחר mitotic נוירונים, והשני הוא היכולת ללכוד תמונות פלורסנט תוך מזעור phototoxicity, photobleaching, ושמירה על בריאות התא הכללי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מתאר שיטה השומנים מבוסס transfection כי התשואות transfection שיעור נמוך יחסית (~ 0.5%), אולם הוא אידיאלי עבור הדמיה של נוירונים מקוטב במלואו. שיעור נמוך transfection חיונית כל כך אקסונים יחיד דנדריטים ניתן לאפיין את האוריינטציה שלהם אל גוף התא כדי לאשר את הכיווניות של תחבורה, כלומר האנטרוגרד נ מדרדר. הגישה שלנו הדמיה GFP להביע נוירונים מסתמך על מיקרוסקופ רחב בתחום תקן פלורסנט ומצויד במצלמה CCD, לכידת תמונה תוכנה, וחדר הדמיה מחומם. יש לנו הדמיה מגוון רחב של אברונים או מבנים, למשל, צפוף ליבות שלפוחית, המיטוכונדריה, חרוטים צמיחה, אקטין ללא אופטיקה מיוחד או דרישות עירור אחר מאשר מקור אור ניאון. בנוסף, spectrally-ברורים, חלבונים שכותרתו fluorescently, למשל, ה-GFP ו-dsRed מתויג חלבונים, יכול להיות בו זמנית ליד דמיינו לאפיין שיתוף תחבורה או אחר אירועים הסלולר מתואמות. הגישה הדמיה המתואר כאן הוא גמיש עבור מגוון של יישומים הדמיה יכול להיות מאומץ על ידי מעבדה בעלות קטנה יחסית בתנאי מיקרוסקופ זמין.

Protocol

חלק 1: transfection של הנוירונים באמצעות Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ציוד הגדרת: חולדה או עכבר נוירונים בהיפוקמפוס הם מתורבתים לפי Kaech והבנקאי, 2006 [4]. צפיפות התאים טיפוסי המשמש transfections הוא 250,000 צלחת cells/6-cm. ריאגנטי?…

Discussion

הדמיה תא חי היא טכניקה מאתגרת, אך רב עוצמה עבור תצפית ישירה של תחבורה אברון בנוירונים בתרבית. הקשיים יכולים לנבוע במעלה הזרם של ההליך עם נוירון בריאות לעניים בשל סיבוכים תרבות. לכן, בריאות תא (לדוגמאות ראו נ"צ. 4) יש לבחון לפני ואחרי transfection ידי התבוננות coverslips בעוד בינ…

Acknowledgements

אנו מודים הרלד Hutter והלנה דקר קריאה זהירה של כתב היד הזה שלהם. כמו כן, אנו מודים רג Sidhu מ Leica Microsystems עבור המומחיות הטכנית שלו. מחקר זה נתמך על ידי למדעים והנדסה המועצה הלאומית של קנדה, פרס # 327100-06, ואת סיימון פרייזר סגל אוניברסיטת המדע.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine Reagent Mediatech 10-010-CV  
Lipofectamine 2000 Reagent Invitrogen 11668-027 Transfection reagent
10X Hanks with Ca2+ and Mg2+ Reagent Gibco/Invitrogen 14185-052 Live-imaging medium
1M HEPES Reagent Gibco/Invitrogen 15630-130 Live-imaging medium

References

  1. Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
  2. Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon. Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).
  3. Barkus, R. V., et al. Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides. Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).
  4. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).

Play Video

Cite This Article
Kwinter, D. M., Silverman, M. A. Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (27), e1144, doi:10.3791/1144 (2009).

View Video