기본 교양 Hippocampal 신경에 덴스 코어 Vesicles의 라이브 영상
Summary
organelle 밀매의 역학을 공부하면 라이브 셀 이미징 특정 유틸리티입니다. 여기 우리는 넓은 필드 형광 현미경을 사용하여 교양 뉴런의 밀도 코어 vesicles의 라이브 영상을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유연 및 mitochondria와 같은 이미지를 다른 organelles 적응 수 endosomes, 그리고 peroxisomes.
Abstract
관찰하고 역동적인 세포 과정을 특성화하는 것은 정적인 이미지에서 얻은 수없는 세포 활동에 대한 중요한 정보를 얻을 수 있습니다. 바이탈 형광 프로브, 특히 녹색 형광 단백질 (GFP)은 특정 세포내 구획과 세포 구조를 분류하는 능력에서 형태소 분석 세포 생물학 혁명을했습니다. 예를 들어, GFP (및 그 변종 스펙트럼) chimeras의 라이브 영상이 생물과 세포 유형 [1-3]는 수많은에 cytoskeleton, organelle 전송 및 멤브레인 역학의 동적 분석을 위해 사용할 수있다. 라이브 영상이 널리 사용되고 있지만,이 방법은 여전히 특히 기본 교양 뉴런에서 많은 기술적인 도전, 포즈. 하나의 문제는 사후 mitotic의 뉴런에 GFP – 태그 단백질의 표현이며, 다른 하나는 photobleaching, 일반 세포의 건강을 유지, phototoxicity을 최소화하면서 형광 이미지를 캡처하는 능력입니다. 여기 우리는 그러나 완전히 양극 뉴런의 이미징에 이상적입니다, 상대적으로 낮은 transfection 속도 (~ 0.5 %) 산출 지질 기반 transfection 방법을 설명하는 프로토콜을 제공합니다. 단일 axons과 dendrites가 anterograde 대 역행 교통, 즉의 방향을 확인하는 세포 기관에 자신의 방향으로 특성화 할 수 있도록 낮은 transfection 속도가 필수적이다. 뉴런을 표현하는 영상 GFP에 대한 우리의 접근 방식은 CCD 카메라, 이미지 캡처 소프트웨어 및 온수 영상 챔버와 복 표준 넓은 필드 형광 현미경에 의존합니다. 우리는 특별한 광학이나 형광등 광원 이외의 여기 조건없이 예를 들어, 고밀도 코어 vesicles, mitochondria, 성장 콘, 그리고 굴지 organelles 또는 구조의 다양한 몇 군데 있습니다. 또한 spectrally – 별개의, 찬란 표시된 단백질, 예를 들면, GFP 및 dsRed – 태그 단백질은, 공동 운송 또는 다른 조정 세포 이벤트를 특성화 동시에 가까운 시각하실 수 있습니다. 여기에 설명된 이미징 접근 이미징 어플 리케이션의 다양한 유연하고 상대적으로 작은 비용 실험실 채택 수있는 것은 현미경을 사용할 수있는 제공됩니다.
Protocol
Discussion
라이브 셀 이미징은 교양 뉴런의 organelle 운송의 직접 관찰하기 위해 도전하지만, 강력한 기술입니다. 어려움 문화 합병증으로 인해 가난한 사람의 신경 세포 건강과 절차의 상류 발생할 수 있습니다. 따라서, 세포 건강 (예제 심판을 참조하십시오. 4) 성장 매체의 조직 문화 라이트 현미경을 사용하는 동안 coverslips을 준수하여 transfection 이전과 이후 평가해야합니다. 전송의 과정을 신경 세포를 포?…
Acknowledgements
우리는이 원고들의주의 읽기위한 해럴드 허터과 헬레나 데커 감사드립니다. 우리는 또한 자신의 전문 지식에 대한 Leica Microsystems에서 등록 Sidhu 감사합니다. 이 연구는 국립 과학 및 캐나다 공학 협의회, 수상 # 327100-06, 과학의 사이몬 프레 이저 대학의 학부에 의해 지원되었다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine | Reagent | Mediatech | 10-010-CV | |
| Lipofectamine 2000 | Reagent | Invitrogen | 11668-027 | Transfection reagent |
| 10X Hanks with Ca2+ and Mg2+ | Reagent | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Live-imaging medium |
| 1M HEPES | Reagent | Gibco/Invitrogen | 15630-130 | Live-imaging medium |
References
- Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
- Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon. Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).
- Barkus, R. V., et al. Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides. Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
