Micromanipulação de células de levedura é necessária para a análise genética meiótica ou para selecionar zigotos diplóides. Estes micromanipulations são realizadas com a microneedle de um microscópio de dissecação. O microagulhas é usado para deslocar as células e é controlado por um micromanipulador, que estão disponíveis com vários graus de automação.
Abstract
A levedura é um sistema modelo altamente tratável que é usado para estudar diversos processos celulares. A cepa comum de laboratório<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Existe em qualquer um haplóide ou estado diplóide. A capacidade de combinar a partir de dois alelos haplóides ea capacidade de introduzir modificações no genoma requer a produção e dissecção de ascos. Asci produção de células haplóides começa com o acasalamento de duas cepas de levedura haplóide com tipos de acasalamento compatíveis para produzir uma cepa diplóide. Isso pode ser feito em um número de maneiras, tanto em meio sólido ou no estado líquido. É vantajoso para selecionar para o diplóides no meio que, seletivamente, promova o seu crescimento em relação a qualquer uma das cepas haplóides. Os diplóides são, então, permissão para esporular em meio de pobres em nutrientes para formar ascos, um conjunto de quatro células-filhas haplóides resultantes de reprodução meiótica do diplóides. Uma mistura de células vegetativas e ascos é então tratado com a zymolyase enzima para digerir o saco do membrana que envolve os ascósporos do ascos. Usando micromanipulação com microagulhas em um microscópio de dissecação um pode pegar ascos individuais e separadas e realocar os quatro ascopores. Ascos dissecados são cultivadas por vários dias e testados para os marcadores ou alelos de interesse por plaqueamento em réplica adequada meios seletivos.
Protocol
Construção de linhagens diplóides Protocolo para a produção de diplóides de reprodução sexuada As cepas inicial deve ser riscado em meio YPD, ou seletivos, se necessário, para produzir colônias único. As duas cepas haplóides deve ser do tipo de acasalamento oposto (isto é, MATA e MATα). Usando um loop de inoculação estéril escolher uma pequena porção de uma colônia de uma das duas estirpes haplóides. Em uma raia novo prato YPD o loop uma vez em uma linha reta ao longo da …
Discussion
Dissecção levedura é uma ferramenta útil para selecionar novas cepas com marcadores desejada. Ao determinar o padrão de crescimento teórico de quatro ascósporos, é importante olhar para o genótipo da célula vegetativa. Se um plasmídeo está presente, é preciso saber se é exemplar único, baixa ou alta, pois isso afetará quais ascósporos (s) receberá o plasmídeo e vai afetar as previsões e conclusões sobre as cepas sendo manipulado.
Certas cepas podem esporular melhor do qu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Trabalho no laboratório do autor é financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde, a Fundação Canadense para Inovação, das Ciências Naturais e Engenharia do Conselho e da Universidade de Concordia.