Dissekering av Saccharomyces cerevisiae ASCI

Summary

Mikromanipulation av jästceller behövs för meiotiska genetisk analys eller för att välja diploida zygotes. Dessa micromanipulations utförs med microneedle en dissektion mikroskop. Den microneedle används för att flytta celler och styrs av en mikromanipulator som finns med olika grader av automatisering.

Abstract

Jäst är en mycket lätthanterlig modell system som används för att studera många olika cellulära processer. Den gemensamma laboratoriet stammen<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Finns i antingen en haploida eller diploida stat. Förmågan att kombinera alleler från två haploids och möjlighet att införa ändringar i genomet kräver produktionen och dissektion av ASCI. ASCI produktion från haploida celler börjar med parning av två stammar jäst haploida med kompatibla parningstyper att producera en diploida stammen. Detta kan göras på flera olika sätt, antingen på fast substrat eller i flytande. Det är fördelaktigt att välja på diploider i medium som selektivt främjar deras tillväxt jämfört med någon av haploida stammar. Den diploider sedan får sporulate på näringsfattiga medellång till formen ASCI, en bunt av fyra haploida dotterceller följd meiotiska reproduktion av diploida. En blandning av vegetativa celler och ASCI behandlas sedan med enzymet zymolyase att smälta bort membranet säck som omger ascospores av ASCI. Använda mikromanipulation med microneedle under en dissektion mikroskop kan man plocka upp enskilda ASCI och separera och flytta fyra ascopores. Dissekerade ASCI odlas i flera dagar och testats på markörer eller alleler av intresse genom att kopian bordläggning på lämpliga selektiva medier.

Protocol

Konstruktion av diploida stammar Protokoll för produktion av diploider vid parning Den ursprungliga stammar bör strykas på YPD eller selektivt medium om det är nödvändigt, för att producera enstaka kolonier. De två haploida stammar bör vara av motsatt parning typ (dvs. Mata och MATα). Använd en steril ympning slinga plocka en liten del av en koloni från en av de två haploida stammar. På en ny YPD tallrik strimma loopen en gång i en rak linje tvärs över plattan. Markera riktni…

Discussion

Jäst dissektion är ett användbart verktyg för att välja nya stammar med önskade markörer. Vid bestämning av teoretiska tillväxtmönster fyra ascospores är det viktigt att titta på genotypen för den vegetativa cellen. Om en plasmid är närvarande, måste man veta om det är singel, låg eller hög kopia som detta kommer att påverka vilka ascospore (s) får plasmiden och kommer att påverka förutsägelser och slutsatser om de påfrestningar som manipuleras.

Vissa stammar kan spo…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Singer MSM System 200	Microscope	Singer Instruments	NA
D-sorbitol	Reagent	BioShop	SOR508
Tris	Reagent	BioShop	TRS001
Zymolyase 100T	Reagent	Seikagaku Corporation	120493
Yeast extract	Reagent	BioShop	YEX401
Peptone	Reagent	BioShop	PEP 403
D-glucose	Reagent	BioShop	GLU501
Yeast nitrogen base	Reagent	BioShop	YNB406
Bio-tryptone	Reagent	BioShop	TRP402
Sodium chloride	Reagent	BioShop	SOD002
Potassium acetate	Reagent	BioShop	POA 301
Agar	Reagent	BioShop	AGR003
Adenine sulfate	Reagent	BioShop	ADS201
L-uracil	Reagent	BioShop	URA 241
L-tryptophan	Reagent	BioShop	TRP 100
L-histidine	Reagent	BioShop	HIS 200
L-arginine	Reagent	Amresco	0877-100G
L-methionine	Reagent	BioShop	MET 222
L-tyrosine	Reagent	BioShop	TYR 333
L-isoleucine	Reagent	BioShop	ISO 910
L-valine	Reagent	BioShop	VAL 201
L-lysine	Reagent	BioShop	LYS 101
L-phenylalanine	Reagent	BioShop	PHA 302
L-glutamic acid	Reagent	BioShop	GLU 202
L-threonine	Reagent	BioShop	THR002
L-leucine	Reagent	BioShop	LEU 222