Protokoll zur Vaccinia-Infektion von HeLa-Zellen und die Analyse von Host-und virale Genexpression.
Abstract
Die Familie<em> Poxviridae</em> Besteht aus großen doppelsträngigen DNA-Viren enthalten, die ausschließlich im Zytoplasma der infizierten Zellen replizieren. Die Mitglieder des<em> Orthopox</em> Gattung gehören Variola, dem Erreger der menschlichen Pocken, Affenpocken und Vaccinia (VAC), der prototypische Mitglied der Virus-Familie. Innerhalb der relativ groß (~ 200 kb) Vaccinia-Genom gibt drei Klassen von Genen kodiert: frühe, mittlere und spät. Während alle drei Klassen von viral-kodierten RNA-Polymerasen transkribiert werden, dient jede Klasse eine andere Funktion im Lebenszyklus des Virus. Pockenviren nutzen mehrere Strategien zur Modulation der zellulären Umgebung Host während der Infektion. Um Regulierung der Wirt und Virus Genexpression verstehen, müssen wir genomweite Ansätze genutzt werden, um Transkript Fülle von beiden Viren und Wirtszellen zu analysieren. Hier zeigen wir, zeitlicher Verlauf Infektionen von HeLa-Zellen mit Vaccinia-Virus und Sampling-RNA zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion. Beide Gastgeber und virale RNA isoliert und verstärkt für die Hybridisierung an Microarrays zur Analyse der Genexpression.
Protocol
Teil 1: Einrichten der Infektion Wachsen HeLa-Zellen in Flaschen und warten, bis die Zellen ca. 80% konfluent sind. Bereiten Sie genug virale Nährboden für das Experiment: regelmäßige DMEM mit 2% FBS und ohne Zusatz von Antibiotika. Die Infektion kann entweder mit einer groben Bestand von Vaccinia-Virus mit einem bekannten Titer, oder Saccharose gereinigten Virus mit einem bekannten Titer, wenn Sie über Host-Genexpression sind besorgt durchgeführt werden. Wenn Sie mit Sacch…
Discussion
Kritische Schritte
Part 1 & 2
Es gibt mehrere wichtige Schritte zum Aufbau einer synchronen Vaccinia-Infektion, wobei die erste sorgfältige Ultraschall (oder trypzinizing) des Virus, um Viruspartikel aufzuschlüsseln. Vaccinia ist sehr anfällig für Aggregation, und die Störung der Viruspartikel ist dafür auch die Infektion der Zellen wichtig. Um eine synchrone Infektion zu erreichen, sollte ein hohes MOI (größer als 2) verwendet werden, um sicherzustellen, …
Acknowledgements
Whitehead Institute Fellows Funds
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
TRIzol Reagent
Reagent
Invitrogen
15596-026
Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work.
Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1. J. Vis. Exp. (26), e1168, doi:10.3791/1168 (2009).