פרוטוקול Vaccinia זיהום של תאים הלה וניתוח של המארח ביטוי גנים ויראליים. חלק 1 מתוך 3.
Abstract
המשפחה<em> Poxviridae</em> מורכב גדילי הדנ"א הכפול גדולים המכילים וירוסים לשכפל אך ורק בציטופלסמה של תאים נגועים. חברי<em> Orthopox</em> הסוג כולל אבעבועות, הסוכן סיבתי של אבעבועות קטנות האדם, הקוף, ואת vaccinia (VAC), חבר prototypic משפחת וירוסים. בתוך גדולות יחסית (~ 200 kb) vaccinia הגנום, שלוש כיתות של גנים המקודדים: מוקדם, ביניים מאוחר. בעוד כל שלוש כיתות מתועתקים ידי virally בקידוד polymerases RNA, כל שיעור מהווה פונקציה שונה במחזור החיים של הנגיף. Poxviruses לנצל אסטרטגיות מרובים עבור אפנון של הסביבה המארחת הסלולר במהלך ההדבקה. כדי להבין את הרגולציה של המארח וגם גן ביטוי וירוס, יש לנו מנוצל הגנום כולו גישות לנתח שפע תמליל מנגיף וגם התאים המארחים. הנה, אנחנו מדגימים כמובן זמן זיהומים של תאים הלה בווירוס Vaccinia ו-RNA הדגימה במספר נקודות זמן לאחר הפגיעה. מארח שני ו-RNA ויראלי הכולל מופרד מוגבר של הכלאה כדי microarrays עבור ניתוח של ביטוי גנים.
Protocol
חלק 1: הגדרת זיהום לגדל תאים הלה ב צלוחיות ולהמתין עד התאים הם כ 80% ומחוברות. הכינו מספיק בינוני צמיחה ויראלי לניסוי: DMEM קבוע עם 2% FBS ללא אנטיביוטיקה הוסיף. הזיהום יכ…
Discussion
קריטי שלבים
חלק 1 & 2
ישנם שלבים קריטיים כמה הגדרת זיהום סינכרוני vaccinia, sonication first להיות זהיר (או trypzinizing) של הנגיף, על מנת disaggregate חלקיקי הנגיף. Vaccinia נוטה מאוד צבירה, לבין שיבוש של חלקיקי נגיף חשוב ל?…
Acknowledgements
וייטהד במכון עמיתי קרנות
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
TRIzol Reagent
Reagent
Invitrogen
15596-026
Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work.
Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1. J. Vis. Exp. (26), e1168, doi:10.3791/1168 (2009).