Протокол Vaccinia заражения клеток HeLa и анализ хозяина и вирусных экспрессии генов. Часть 1 из 3.
Abstract
Семья<em> Poxviridae</em> Состоит из больших двухцепочечной ДНК, содержащие вирусы, которые копируют только в цитоплазме инфицированных клеток. Члены<em> Orthopox</em> Рода включают натуральной оспы, возбудитель человеческого оспа, обезьяньей, и вакцины (VAC), прототипных член вирус семьи. В течение относительно большого (~ 200 кб) вакцины генома, три класса гены закодированы: ранние, средние и поздние. Хотя все три класса транскрибируются вирусно-закодированных РНК-полимеразы, каждый класс выполняет различные функции в жизненном цикле вируса. Poxviruses использовать несколько стратегий для модуляции хост клеточного окружения во время инфекции. Для того чтобы понять регулирования хозяина и выражение гена вируса, мы использовали генома подходы к анализу стенограммы изобилии от обоих вирусов и клеток-хозяев. Здесь мы демонстрируем время курс инфекции клеток HeLa с вирус коровьей оспы и отбора проб РНК в нескольких точках времени после заражения. Оба хозяина и вирусных общей РНК выделяют и усиливаются для гибридизации микрочипов для анализа экспрессии генов.
Protocol
Часть 1: Настройка инфекции Расти HeLa клеток в колбах и ждать, пока клетки приблизительно на 80% вырожденная. Подготовка достаточно вирусных питательную среду для эксперимента: регулярные DMEM с 2% ЭТС и без добавления антибиотиков. Инфекция может быть выполнена либо с сырой…
Discussion
Критические Шаги
Часть 1 и 2
Есть несколько важных шагов для создания синхронной инфекции вакцины, первая из которых осторожны ультразвуком (или trypzinizing) вируса, чтобы разбить вирусных частиц. Vaccinia очень склонны к агрегирования, и нарушение вирусных частиц им…
Acknowledgements
Уайтхед Институт стипендиаты фондов
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
TRIzol Reagent
Reagent
Invitrogen
15596-026
Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work.
Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1. J. Vis. Exp. (26), e1168, doi:10.3791/1168 (2009).