Kärnöverföring till Mouse oocyter

Summary

Denna film och protokollet är avsedda att hjälpa lära kärnöverföring.

Abstract

Kärnöverföring till en obefruktade ägget kan återställa utvecklingspotential i en differentierad cell. Detta visar att de processer som ligger bakom utvecklingen, differentiering och åldrande är epigenetisk snarare än genetisk processer. Reversibiliteten av dessa processer öppnar spännande perspektiv inom grundforskning och på mer avlägsna framtiden, regenerativ medicin. I musen kan embryonala stamceller hämtas från klonade embryon preimplantatorisk skede. Sådana embryonala stamceller har förmågan att ge upphov till alla celltyper i den vuxna organismen. Viktigare är att dessa celler är genetiskt identiska till donatorn. Om tillämpligt för människors, skulle detta göra det möjligt härledning av stamceller från en patient. Dessa celler kan sedan delas in i de drabbade celltyp av patienten och studerade in vitro, eller användas för att ersätta skadade eller saknade celler. Studien av kärnöverföring i musen är viktig eftersom den kan upplysa oss om principerna för kärnkraft omprogrammering. Den här filmen och den åtföljande protokollet är avsedda att hjälpa lärandet kärnöverföring hos mus, en metod som först utvecklades i den grupp av professor Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

Protocol

Förberedelser:

1. En detaljerad beskrivning av superovulation och microdrop embryo kultur kan hittas någon annanstans ^2.
2. Förbered en petriskål med microdrops av embryon odlingssubstrat (t.ex. KSOM, Chemicon). Täck med mineralolja (mineralolja partier bör testas för kompatibilitet med embryo kultur). Utjämna till 37 ° C i luft plus 5% CO _2. (I Thermo-Electron 3110 vatten mantlade inkubator eller motsvarande)
3. Förbered en maträtt för isolering av oocyter: Placera droppar Hepes buffrad CZB & hyaluronidas (0,1% w / v, Sigma) i ena halvan av skålen och HCZB i den andra hälften. Täck med mineralolja. Håll skålen varm på en uppvärmd skede av en dissektion mikroskop.
4. Förbered mikroskop: Placera ett innehav pipett med en yttre diameter på ca 50 μ m (något mindre än diametern på ägget), och en öppning på ca 20 μ m en pipett hållaren. Holding pipetter är lätta att göra med nödvändig utrustning, en nål avdragare (Sutter instrument) och en microforge (Narishige), men de kan också köpas från Humagen.
   
   Belastning 3-5 kvicksilver μ L i svansen på en mikropipett (innerdiameter 8 μ m). Undvik kvicksilverspill. Förbered ett fat med flera små droppar vardera 11% w / v PVP (polyvinylpyrrolidon) i HCZB och 5 μ g / ml cytochalasin B i HCZB. Använd locket på en petriskål snarare än skålen själv som locket har en kort fälg som inte kommer att störa flödet av innehavet och pipetter enucleation. Rikta hålla pipetten och enucleation pipetten HCZB släpp. Aspirera lite HZCB i spetsen av innehavet pipetten.
5. Beredning av donator celler beror till stor del på celltyp och experimentet utredaren avser att utföra. I allmänhet bör givarnas celler behandlas med en proteolytiskt enzym som trypsin och förvaras på is för att minska klibbighet tills överföringen.
6. Humant sätt avliva möss 14-15 timmar efter administrering av hCG. Harvest äggledarna och dissekera dem i den varma HCZB-hyaluronidas droppar. Efter ca. 5 min, kommer oocyter vara mestadels fri från cumulus celler. De bör då tvättas flera gånger i HCZB, sedan tvättas ytterligare i pre-jämvikt KSOM droppar, och hålls i inkubatorn tills enucleation.

Enucleation

Manipulationer görs med hydraulisk micromanipulators, (Narishige) på ett inverterat mikroskop, som Nikon TE200. En piezo-mikromanipulator (Primetech) används för att borra zona pellucida. Platt spets enucleation och pipetter överföring kan köpas från Humagen. Rengör och smörj enucleation pipetten i PVP droppar genom att utvisa mikroskopiska kvicksilver droppar och genom att aspirera och utvisa PVP. För att förhindra klibbighet av nålen, bör samma förfarande ske mellan varje grupp av oocyter som antingen enucleated eller överförs.

Placera en liten grupp av äggceller till HCZB-cytochalasin B-släpp. Storleken på gruppen bör anpassas till graden av erfarenhet av utredaren. Oocyter bör inte hållas på scenen längre än 20-30 min. Flytta instrumenten till HCZB-cytochalasin B-droppar. Innehavet pipetten och enucleation pipetten bör bringas i linje med de ekvatoriella plan äggcellen. Detta blir möjligt om innehavet pipetten har en ytterdiameter som är något mindre än äggcellen själv. Rotera ett äggcellen tills annorlunda brytningsindex metafas spindel kan ses. Om en nybörjare inte kan se spindeln kan metafas plåten kan identifieras med hjälp av DNA-dye Hoechst och UV-belysning, men det är inte förenligt med ett effektivt embryots utveckling. Placera metafas spindeln klockan 3 och håll det väl med att hålla pipetten. Applicera piezo pulser att penetrera zona pellucida. Peka på metafas plattan med enucleation pipetten. När motståndet i metafas spindel kan vara "känt", aspirera spindeln och dra ut nålen. Äggcellen cytoplasma är flytande, flyttar metafas spindeln dock som en klump vid beröring med pipett. Försök att minska mängden cytoplasman som avlägsnas med spindeln. Efter en grupp av oocyter har enucleated, tvätta dem genom embryo odlingsmedium och placera dem i inkubatorn tills överföringen. Vissa enucleated oocyter bör inte överlåtas men bör aktiveras och fungera som en kontroll för enucleation. Dessa ägg kommer fragmentet inom flera timmar, vilket indikerar lyckade enucleation.

Kärnöverföring

Placera celler till PVP-lösning (11% PVP i HCZB). Om många kloner gripandet vid 1-cell skede bör PVP koncentration sänkas till 5% eller mindre. Blanda celler bra with PVP. Plocka upp celler med en pipett med en inre diameter som är något mindre än diametern av cellen. I cellens membran skulle gå sönder vid aspiration. I vissa fall kan repetitiva utvisa och aspiration samt tillämpning av milda piezo pulser användas för att bryta givaren cellen. En ny droppe donator celler bör göras med varje grupp av oocyter som överförs, som donator celler blir klibbig efter en tid. Injicera den trasiga givaren cellen strax efter att bryta membranet. För överföringen, fokusera på de ekvatoriella planet av äggcellen själv snarare än de ekvatoriella planet av zona pellucida och placera överföring och hålla pipetten i samma plan. Håll äggcellen, inklusive en del av dess cytoplasma ordentligt. Penetrera zona pellucida med piezo-pulser. Ta givaren kärnan till toppen av pipetten och tryck sedan pipettspetsen nästan på motsatt sida av enucleated äggcellen, nära innehavet pipett gör en djup fåra i äggcellen. Aspirera en mycket liten mängd äggcellen cytoplasman i pipetten, tillämpa en enda svag piezo puls att bryta äggcellen membranet, mata givaren kärnan, dra tillbaka nålen snabbt samtidigt som aspirerande på cytoplasmamembran längst till höger i fåran. Genom att samtidigt dra ut kanylen och aspirerande, bör det vara möjligt att stänga hål kvar av NT. Denna "hål borttagning tekniken kommer att minska antalet oocyter som Lyse under NT. Tvätta rekonstruerade ägg i KSOM och returnera dem till inkubator för 1-3 timmar.

Äggcellen aktivering

Förbered en halv tallrik med droppar av kalcium gratis MCZB och den andra hälften med droppar av kalcium gratis MCZB plus 10 mM Sr ^{2 +} och 5 μ g / ml cytochalasin B för att hämma polära kroppen extrudering. Jämvikta i 30 min. under 5% CO ² i luften. Tvätta NT embryon bra i kalciumfri MCZB och sedan placera dem i små grupper i olika droppar kalciumfri MCZB. Återgå skålen till inkubatorn och kultur i 5-6 timmar. För att kontrollera för den artificiella aktiveringen protokoll och för embryo odlingsbetingelser bör icke enucleated ägg användas. De kommer att utvecklas som partenogenetiska embryon. Efter aktivering, tvätta embryon genom KSOM och placera embryon i inkubatorn för långsiktig kultur. Pronuclei skall vara synliga vid denna tidpunkt, vilket indikerar en framgångsrik överföring.

Embryo Culture Media kokbok

Mästare Salter

Börja med 980 ml ​​ultrarent H ₂ O i sterila 1 L flaska

Lägg torr komponenter:

NaCl 4760 mg (81mm) Sigma S-5886
KCl 360 mg (5 mm) Sigma P-5405
MgSO ₄ • 7H ₂ O 290 mg (1.18mM) Sigma M-2773
KH ₂ PO ₄ 160 mg (1.17mM) Sigma P-5655
EDTA 2NA 40 mg (0,1 mm) Sigma E-6635
Glukos (D) 1000 mg (5,5 mm) Sigma G-6152

Lägg till likvida komponenterna

Na-laktat (mjölksyra) 5,3 mL & nbsp; Sigma 44.263
Pen'Strep 10 ml Gibco 15.140-122

För MCZB Stock Salter:

Filtrera sterilisera 500 salter ml mästare (bra för 3-4 månader, förvaras vid 4 ° C)

För HCZB Stock Salter:

Börja med 500 ml mästare salter

Tillsätt 50 mg PVA (kall-lösliga, Sigma P-8136)

Rör i 30-60 min och sterila filter (bra för 3 månader, förvaras vid 4 ° C)

Ca ^{+ +} Gratis MCZB (för ägg aktivering i 5% CO ₂₎

Börja med 99 ml MCZB lager salter

Lägg torr komponenter:

NaHCO ₃ 211 mg Sigma S-5761

Na-pyruvat (pyrodruvsyra) 3 mg Sigma P-4562

L-Glutamin 15mg Sigma G-8540

Bovint serumalbumin (BSA) 500 mg Sigma A-3311

Snurra tills alla komponenter är upplöst, sterila filter.

HCZB (för mikromanipulation i omgivande atmosfär)

Börja med 99 ml HCZB lager salter

Lägg torr komponenter:

Hepes-Na 520 mg Sigma H-3784

NaHCO ₃ 42 mg Sigma S-5761

Lägg till likvida komponenterna:

128 mm CaCl ₂ (18.8g / l) 1 ml Sigma C-7902

Justera pH till 7,5 med 1 N HCl

Snurra tills det är upplöst, sterila filter.

Discussion

Lycka till!

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytochalastin B	Sigma-Aldrich		100x stock = 500 µg/ml Cytochalasin B in DMSO. Store at -20 ˚C.
Strontium Chloride			10x stock = 100 mM SrCl2 in H2O. Store at room temperature.
MCZB Stock Salts			Filter sterilize 500 ml master salts (good for 3-4 months; store at 4 ˚C)
HCZB Stock Salts			Start with 500 mL master salts. Add 50 mg PVA. Stir for 30-60 min and sterile filter (good for 3 months; store at 4 ˚C).
PVA	Sigma-Aldrich	P-8136	cold-soluble
HCZB with 11% w/v PVP			Start with 20 ml HCZB medium in a 50 ml conical tube. Place 22 g PVP on top of liquid. Close tube and store undisturbed at 4 ˚C for 72 – 96 hr, at which time the PVP will have entered solution. Filter sterilize through an 8 mm filter and store at 4 ˚C.
PVP	ICN Biomedicals		MW 360,000
Please check for additional buffers compositions in the Protocol part.