Summary
이 문서는 소설 프로토콜 및 시약 높은 컨텐츠 분석을 사용하여 뉴런과 astrocytes의 공동 문화 화합물과 치료의 neurotoxic 효과 민감한 측정을위한 설정에 대해 설명합니다. 결과는 높은 컨텐츠 분석 neurotoxicity 평가에 대한 흥미 진진한 소설 기술을 대표하는 것을 보여줍니다.
Abstract
하이 컨텐츠 분석 (HCA) assays은 단일 분석에서 여러 세포 phenotypes의 측정을 수 있도록 자동 이미징과 강력한 이미지 분석 알고리즘 세포 검출 시약을 결합. 본 연구에서는, 우리는 neurotoxicity에 대한 소설 분석을 개발하는 HCA를 활용. Neurotoxicity 평가는 중요한 약물 안전 평가의 일부뿐만 아니라, 환경 보호 노력의 중요한 초점이되고를 나타냅니다. 또한, neurotoxicity는 잘 접수
Protocol
셀 준비 :
- 성장 미디어 분석, 문화 뉴런 / astrocytes에 대한 셀 시딩 이전까지 ~ 70-80%의 합류 (세포 해동하거나 고립에서 직접 시딩 제외).
- 관심 세포 유형에 적절한 방법을 통해 문화 flasks / 접시에서 세포를 분리합니다. 필요한 경우, 폴리 - D - 라이신 또는 세포외 기질 단백질로 코트 분석 플레이트 우물은 세포 접착력을 향상시키기 위해. astrocytes와 뉴런의 공동 문화가 동시에 또는 순차적으로 씨앗을 품고있을 수 있습니다. 순차 seedings 들어, "기초"레이어 첫번째 astrocytes의 도금이 필요한 경우의 연결을 도금과 차별화 뒤에, 권장합니다. 셀 유형, 후속 문화 시간, 관심의 매개 변수에 맞게 셀 밀도를 조절 등 문화 시대에 따라, 세포의 소스와 시딩 밀도는, 기본 문화 확산, GFAP 표현이나 neurite의 파생물의 속도에 크게 차이가있을 수 있습니다 - 그것은 중요합니다 특징과 가장 생물 학적 귀하의 실험 모델 관련뿐만 아니라 HCS를 (그림 1 참조)를 사용하여 효과적인 영상, 세분화 및 분석을 위해 제공을 제공하기 위해 전지 시스템을 최적화합니다. 플레이트 (셀은 다음 3 단계에서 설명한대로 독소의 치료를 촉진하기 위해, 90 μL 언론에 씨앗을 품고있을 수 있습니다)에 세포를 추가한 후에, 플레이트도 휴대폰 유통을 활성화, 15-30 분 실온에서 수준의 표면에 앉을 수 있습니다. 이 기간에 따라, 적어도 24 시간 동안 성장 미디어에 품어 세포 (37 ° C / 5% CO 2) 다음, 차별화 문화 조건으로 전환 (예를 들어, PC12 세포에 대한 낮은 혈청 / NGF), 적절하게. 세포가 세포 유형에 적절한 간격으로 미디어를 변경 합류 또는 분화의 원하는 수준에 도달할 때까지 문화를 계속합니다.
- 세포 치료 (제어 화합물, 시험 화합물 등)의 관심 치료 시간 코스에 따라,이 문화 기간 동안 어느 시점 도입하실 수 있습니다. 아크릴 아미드, 과산화수소와 K - 252A는 neurotoxic 제어 화합물로 제공됩니다. 충분한 시약은 모두 다섯 96 - 웰 플레이트에 대한 중복 12 포인트 선량 반응 곡선 (선량 반응 내의 DH 2 O 또는 DMSO 제어 세트 포함) 제공됩니다. 화합물은 250X 농도 (K - 252A에 대해 1 μm의 최대 치료를 가정) 또는 10X (아크릴 아미드와 과산화수소에 대해 각각 100 MM 10 MM, 최대 트리 트먼트를 가정)에서 제공합니다. 추천 치료 준비 반 로그인 관련 :에 복잡 희석 버퍼에 희석하여 다음 (1 √ 10) DMSO의 250X 화합물의 시리얼 희석을 10X (DH 2 O에서 발생하는 10X 제어 화합물은 순차적으로 살균 DH 2 O에 직접 희석 수 있습니다 또는 복합 희석 버퍼). 각각의 치료 10 μL 그런 다음 최종 1X 농도 (0.4 % DMSO 또는 10% DH 2 O)에 대한 각 우물에 이미 현재 문화 미디어의 90 μL에 추가할 수 있습니다. 샘플 데이터는 ° C 이전에 고정하기 37 복합 치료의 24 또는 96시간 제공됩니다.
세포 고정과 Immunofluorescent 스테 이닝 :
참고 : 스테 이닝 시간이 ~ 2.5 시간 후 고정합니다. 우물은 얼룩 단계 사이 건조하는 것을 허용하지 않습니다. 시약의 열망과 분배는 유체 전단으로 인한 세포 손실을 감소하기 위해 낮은 흐름 속도에서 실시하여야한다. 모든 권장 볼륨 '잘 당'은 96 잘 microplate 잘 하나를 참조하십시오. 볼륨 '96 - 웰 플레이트마다'전체 권장 액체 처리 볼륨 손실 25 % 초과를 포함합니다. 모든 얼룩 단계 실온 (RT)에서 수행됩니다. 모든 버퍼와 항체 솔루션은 RT 적어도 24 시간 동안 안정합니다.
- 문화 기간의 끝에, 실온 (RT) 또는 37 º C로 사전에 따뜻한 HCS의 고정 솔루션 (2X) (12 mL/96-well 플레이트) 원하는 경우. 화학 펌 모자 / 물론 직접적인 문화 매체에 100 μL를 추가하고 RT에서 30 분 수정하실 수 있습니다. (MSDS 참조) 정착액 / 독소 함유 미디어를 제거하고 유해 폐기물에 대한 규정에 따라 처리. 얼룩 즉시 진행하는 경우, HCS Immunofluorescence 버퍼 200 μL와 각각 두 번 잘 씻어. 또는, 접시는 나중에 스테인드 수있다면, 우물과 긴밀하게 얼룩까지 4 º C에서 밀봉 저장 플레이트에서 두 번째 린스 볼륨을두고 다음 씻어 버퍼 200 μL로 두 번 씻어.
- 고정 샘플 전에 얼룩 4 º C에 저장되어있다면, 얼룩 프로토콜하기 전에 200 μL HCS Immunofluorescence 버퍼로 두 번 씻어.
- 다음과 같이 래빗 방지 βIII Tubulin / 마우스 방지 GFAP HCS 차 항체 (6 mL/96-well 판)의 솔루션을 작업 준비 : HCS Immunofluorescence 버퍼의 5.88 ML 각 해동 기본 항체의 60 μL를 추가합니다. 잘 섞는다. 이전 Immunofluorescence 버퍼 린스 제거합니다. 각 잘하는 차 항체 용액 50 μL를 추가하고 RT에서 1 시간 동안 부화.
- 차 항체를 제거솔루션입니다. 200 μL HCS Immunofluorescence 버퍼로 세 번 씻어.
- 다음과 같이 HCS 차 항체 / Hoechst HCS 원자력 스테인 (6 mL/96-well 판)의 작업 솔루션을 준비 : 각 해동 이차 항체의 30 μL 및 해동 Hoechst HCS 원자력의 30 μL HCS Immunofluorescence 버퍼의 5.91 ML에 얼룩을 추가합니다. 빛과 솔루션을 보호, 잘 섞는다. 이전 HCS Immunofluorescence 버퍼가 씻어 제거합니다. HCS 차 항체 / Hoechst HCS 원자력 스테인 솔루션을 50 μL를 추가하고 빛으로부터 보호 RT, 1 시간 동안 부화.
- HCS 차 항체 / Hoechst HCS 원자력 스테인 솔루션을 제거합니다. 200 μL HCS Immunofluorescence 버퍼로 두 번 씻어.
- 이전 HCS Immunofluorescence 버퍼가 씻어 제거합니다. 우물에서 두 번째 린스 볼륨을 떠나, HCS 워시 버퍼 200 μL로 두 번 씻어.
- 4 º C 즉시 인감 판과 이미지 또는 저장 판은 영상에 대한 준비까지 빛으로부터 보호.
이미지 수집 및 분석 :
- 스테인드 접시의 이미징 및 분석은 세포 분석기 (GE 헬스케어)를 포함 가능 HCS 플랫폼, ArrayScan (ThermoFisher 과학) 또는 오페라 (퍼어킨 엘머)의 다양한시 수행할 수 있습니다. 이미징 및 분석을위한 몇 가지 지침은 표 1에서 제공됩니다 :
| HCS222 이미지 수집 가이드 | |||
| 탐지 시약 | 목표 렌즈 | 여기 필터 범위 [피크 / 대역폭 (NM)] | 배출 필터 범위 [피크 / 대역폭 (NM)] |
| Hoechst HCS 핵은 스테인 | 20X | 40분의 360 | 40분의 460 (또는 필요한 경우 50분의 535) |
| HCS 차 항체, FITC - 돈키 안티 - 토끼 IgG | 20X | 40분의 480 | 50분의 535 |
| HCS 차 항체, Cy3 - 돈키 안티 - 마우스 IgG | 20X | 50분의 535 | 50분의 600 |
HCS222 이미지 분석 가이드 | |||
| 세포 매개 변수 | 검색 | 세그먼트 / 측정 | 이론적 해석 |
| 휴대폰 번호, 핵 특성 | Hoechst HCS 핵은 스테인 | 원자력 지역 (460 NM 방출 채널). 핵의 개수를 계산합니다. DNA 내용 (핵 강도) 또는 핵 영역 분석도 가능합니다. | 별도의 연결 및 astrocytic 셀 카운트 / characterizations를 (권장)을 구하는 βIII - tubulin 또는 GFAP 표현과 관련된들을 위해 핵을 "필터링"할 수 있습니다 셀 손실, 독성 phenotypes 등을 확인하기 위해 휴대폰 번호, 핵 특성을 사용합니다. |
| βIII - Tubulin의 표현, Neurite의 파생물 | HCS 차 항체, FITC - 복합 | 세포질 영역 (535 nm의 방출 채널). FITC 신호 neurites (예 : 최소 / 평균 셀 신체 영역, 최소 / 최대 neurite의 길이와 넓이를 통해)에서 세포의 연결 기관을 구분하는 데 사용할 수 있습니다. 등 총 neurite의 길이, neurite 카운트 / 휴대폰 등 매개 변수를 결정 | Neurite의 가지 측정의 연결을 차별화하는 동안이나 화학 부상, 질병 상태 등의 결과로 변조된 수 있습니다 별개의 연결 특성을 (권장)을 구하는 βIII - tubulin 표현과 관련된들을위한 "필터"셀 단체 수있다. |
| GFAP의 표현, Astrocyte 지역 | HCS 차 항체, Cy3 - 복합 | 세포질 영역 (600 NM 방출 채널). Cy3 신호 astrocytic 세포질 세그먼트를 정의하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 평균 세포질 신호 강도, 셀 영역 등 매개 변수를 결정 | GFAP의 표현과 astrocyte 세포 영역 astrocyte 개발하는 동안이나 화학 부상, 질병 상태의 결과로 변조된 수 등 독특한 astrocytic 특성화를 (권장)을 구하는 GFAP 표현과 관련된들을위한 세포 기관을 "필터링"할 수도있다. |
. 표 1 이미지 수집 및 분석 지침 - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (CO - 문화) 어세이
대표 결과 :
그림 1. βIII - tubulin과 GFAP immunofluore혼합 쥐의 신경 세포 문화의 카메라는.
기본 쥐 hippocampal 뉴런 또는 쥐 PC12 세포 중 하나와 함께 기본 쥐 hippocampal astrocytes의 공동 문화가의 연결 시딩 다음에 문화에 며칠에 대한 사전 도금 astrocytes에 의해 생성되었습니다. PC12s가 차별화의 조건 (낮은 혈청 / NGF)에서 추가로 2 일간 교양 동안 차 뉴런은 추가 11일에 대한 교양되었습니다. 세포 처리, 고정 및 immunostaining은 HCS222 분석 프로토콜에 따라 수행되었다. 전지는 20X (주 뉴런) 또는 10X (PC12) 객관적인 배율에서 세포 분석기 1000 (3.3)에서 GE에 몇 군데와 세포 분석기 1000 워크 스테이션 (3.4) Neurite의 파생물 및 멀티 타겟 분석 알고리즘에서 GE를 사용하여 분석되었다 톱 패널. : Hoechst HCS 스테인 원자력 (파란색), βIII - tubulin (녹색) 및 GFAP (적색) 형광의 융합 영상. (세포 기관 파란색 (주 뉴런에 명시된) 또는 노란색 (PC12), 그린 (주 뉴런) 또는 하늘색 (PC12)에 neurites 가운데 패널) βIII - tubulin의 형광 채널의 분리 분석 neurite 가지 세분화를위한 수 있습니다. GFAP 채널의 분석 astrocyte 세분화 (핵 녹색 파랑, 세포질에 명시된 하단 패널)에 있습니다. 에 대해 별도의 셀 계산을 지원, (적색) (-) 기본 쥐 hippocampal 신경 / astrocyte 공동 문화 GFAP 세분화는 핵 / 세포 GFAP (+) (녹색 윤곽선)입니다 신체와 GFAP하는 사람을 구별하는 능력을 보여줍니다 혼합 문화 환경에서 뉴런과 astrocytes. 
그림 2. 기본 쥐 선량 반응 hippocampal 신경 / 독성 스트레스에 공동 문화 astrocyte.
기본 쥐 hippocampal astrocytes는 (P6) 성장 미디어 96 - 웰 플레이트에 도금 6 일 동안 교양되었습니다. 기본 쥐 hippocampal 뉴런은 (해동 직접) 다음 사전 도금 astrocytes 위에 씨앗을 11 일 동안 성장 미디어에 교양되었습니다. 세포 문화의 마지막 24 시간 동안 아크릴 아미드 또는 수소 과산화물 (최대 농도 = 100mM 및 10mM, 각각)의 시리얼 dilutions로 치료했다. 세포 처리, 고정 및 immunostaining은 HCS222 분석 프로토콜에 따라 수행되었다. 전지는 20X (물론 10 필드 /)에서 세포 분석기 1000 (3.3)에서 GE에 몇 군데와 세포 분석기 1000 워크 스테이션 (3.4) Neurite의 파생물 및 멀티 타겟 분석 알고리즘에서 GE를 사용하여 (세포질 / 핵 / neurite 세분화) 분석했다. 표시 데이터 굴어요 ± SEM, N = 3. 여러 매개 변수 (neurite 가지, GFAP 강도, astrocyte 지역의 연결 또는 astrocytic 셀 카운트) 선량에 의존 동향에 대해 조사했다.
Discussion
지금까지, 뉴런과 astrocytes의 혼합 문화를 사용하여 neurotoxicity 위험 평가를 공부하기위한 체외 실험에서 제한되었습니다. 그것은 glial 세포가 뉴런에 공간과 신진 대사 지원을 제공 통합하고 있으며,의 연결을 마이 그 레이션, 분화와 시냅스 활동을 포함한 여러 modulating의 연결 기능에 중요한 역할을 것을 잘 허용됩니다. Glial astrocytes 또한 크린 시토킨 많은 독소의 양쪽의 연결 조직을 둘러싼에 불리한 반응을 유도뿐만 아니라 홍보의 연결을 허용 수있는 다른 가용성 요소를 놓습니다. 이러한 항산화 방어하고 세포의 에너지 수준의 유지 보수와 같은 astrocytic 기능의 장애가로 표시되었습니다 반면에의 연결 - glial 상호 작용의 깊이를 보여주는, 공동 문화 연구에 astrocytes은 산화 스트레스의 독성에 대한 뉴런을 보호하기 위해 표시되었습니다 비판적으로의 연결을 생존에 영향을 미칩니다. 최근 연구는 체외의 neurotoxicity 테스트 - 시스템에 astrocytes의 사용 혼자의 연결을 세포보다 인간의 중추 신경계의 구조와 기능 관련성이 될 수 있습니다 것을 제안했습니다. 의 연결 - astrocytic 상호 작용의 생리적 의의의 성장 인식에도 불구하고, 그것은 이전 그대로 세포에서 이러한 상호 작용의 양적 분석을 수행하기 어려운되었습니다. 하이 컨텐츠 스크리닝의 출현은 강력한 새 assays의 개발이이 문제를 해결할 수 있습니다.
본 연구에서는, 우리는 하나의 분석에서 여러의 연결 및 astrocytic phenotypes의 양적 분석은 HCA에 의해 가능하게 한 것을 증명하고있다. 기본 뉴런에서 우리는의 연결 번호, neurite 카운트와 neurite 길이로 neurotoxicity 마커의 양적 측정을 수행했습니다. astrocytes에 반응 gliosis는 GFAP 표현, astrocyte 번호 astrocyte 형태의 변경에 의해 특징 neurotoxicity의 알려진 biomarker입니다. 우리는이 끝점 각각이 쉽게 HCA를 통해 평가 수 증명하고있다. 이 연구는 신경 특정 생체 HCA가 급속하게 neurotoxic 종점에 대한 화학 물질의 큰 숫자를 화면으로 체외 테스트에의 배터리의 일환으로 사용될 수있는 개념을 지원합니다.
뉴런과 astrocytes의 공동 문화 Millipore의 HCS222 하이 컨텐츠 분석 키트는 고품질 탐지 시약 동시에 neurotoxicity의 세포 모델의 다양한 βIII - tubulin과 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP)를 프로 파일링을위한 프로토콜로 구성되어 있습니다. 이 키트와 함께 제공되는 높은 유효 시약은 사용자가 assays을 표준화 분석 - 투 - 분석 변화를 최소화하고, reproducibly 높은 신호 대 배경 비율로 이미지를 생성하실 수 있습니다.
Disclosures
저자는 Millipore Corporation의 모든 임직원 수 있습니다.
Acknowledgments
저자 DRS 감사하고 싶습니다. 릭 라이언, Umesh 파텔, 제프까지, 매튜 수의, Jehangir Mistry 이러한 프로젝트 및 프로토콜의 개발 기간 동안 지원 미쉘 Hatler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit Anti-βIII-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201672 | 1 vial containing 300 μL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X | Part No. CS201649 | 1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201671 | 1 vial containing 300 μL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X | Part No. CS200437 | 1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component |
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| H–chst HCS Nuclear Stain, 200X | Part No. CS200438 | 1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X | Part No. CS200434 | 1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Immunofluorescence Buffer, 1X | Part No. CS200435 | 1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| HCS Wash Buffer, 1X | Part No. 2007643 | 1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components |
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| Acrylamide (Control Compound), 10X | Part No. CS201679 | 1 vial containing 500 μL of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component |
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| Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X | Part No. CS201730 | 1 vial containing 500 μL of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components |
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| K-252a (Control Compound), 250X | Part No. CS201741 | 1 vial containing 100 μL of 250 μM K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component |
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| DMSO for Compound Serial Dilution | Part No. CS200441 | 1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Compound Dilution Buffer | Part No. CS200442 | 1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component |
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| Plate Sealers | Part No. CS200443 | 10 each Millipore HCS222 Kit Components |
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| tissue culture-treated black/clear bottom microplates | |||
| HCS imaging/analysis system |
References
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