Summary
Dit artikel beschrijft een nieuw protocol en reagensset ontworpen voor de gevoelige meting van de neurotoxische effecten van verbindingen en behandelingen op co-culturen van neuronen en astrocyten met behulp van hoge inhoudsanalyse. Resultaten tonen aan dat de hoge inhoudelijke analyse een spannende nieuwe technologie voor neurotoxiciteit assessment vertegenwoordigt.
Abstract
Hoge Content Analysis (HCA) assays combineren cellen en detectie reagentia met geautomatiseerde beeldvorming en krachtige beeldanalyse algoritmen, waardoor de meting van meerdere cellulaire fenotypes binnen een enkele assay. In deze studie hebben we gebruik gemaakt HCA om een nieuwe test voor neurotoxiciteit te ontwikkelen. Neurotoxiciteit assessment is een belangrijk onderdeel van de Drug Safety Evaluation, maar ook als een belangrijk aandachtspunt van de bescherming van het milieu inspanningen. Bovendien, neurotoxiciteit is ook een goed geaccepteerde
Protocol
Cel Bereiding:
- Voorafgaand aan de cel zaaien voor de test, cultuur neuronen / astrocyten in groeimedia tot ~ 70-80% samenvloeiende (tenzij de cel zaaien direct van dooi of isolatie).
- Los cellen van cultuur flessen / platen via methode geschikt is voor celtype van belang. Indien nodig, de vacht testplaat putten met poly-D-lysine of extracellulaire matrix eiwit te verbeteren celadhesie. Co-culturen van astrocyten en neuronen kan gelijktijdig of opeenvolgend worden gezaaid. Voor sequentiële uitzaaiingen, is plating van astrocyten eerst als een "basale" laag aanbevolen, gevolgd door neuronale plating en differentiatie, indien nodig. Pas celdichtheid in voorkomend geval voor celtype, de daaropvolgende tijd cultuur, parameters die van belang, etc. Afhankelijk van de cultuur leeftijd, cel bron en zaaien dichtheid, kunnen primaire culturen sterk variëren in mate van proliferatie, GFAP expressie of neurietuitgroei - het is belangrijk om karakteriseren en optimaliseren van uw mobiele systeem om de meest biologische relevantie voor uw experimenteel model, maar ook te voorzien in effectieve beeldvorming, segmentatie en analyse met behulp van HCS (zie figuur 1) te verstrekken. Na het toevoegen van cellen tot op het bord (cellen kunnen worden gezaaid in 90 ui media, om toxine behandeling te vergemakkelijken, zoals beschreven in stap 3 hieronder), laat plaat om op een vlakke ondergrond zitten bij kamertemperatuur gedurende 15-30 minuten, zodat zelfs mobiele distributie. Na deze periode, incubeer cellen in groei media (37 ° C / 5% CO 2) gedurende ten minste 24 uur, schakel dan over naar differentiatie cultuur omstandigheden (bijvoorbeeld, een lage serum / NGF voor PC12 cellen), naargelang het geval. Ga door de cultuur tot de cellen te bereiken gewenste niveau van samenloop of differentiatie, het veranderen van de media met tussenpozen geschikt zijn voor cel-type.
- Cel behandelingen (controle verbindingen, test verbindingen, etc.) kunnen worden ingevoerd op elk moment tijdens deze cultuur periode, in voorkomend geval voor het tijdsverloop van de behandeling van belang. Acrylamide, waterstofperoxide en K-252 bis worden geleverd als neurotoxisch controle verbindingen. Voldoende reagentia zijn voorzien voor dubbele 12-punts dosis-respons curves (met inbegrip van een dH 2 O of DMSO-controle ingesteld binnen de dosis-respons) voor alle vijf 96-wells platen. De verbindingen zijn verstrekt op 250X concentratie (voor K-252 bis, uitgaande van een maximale behandeling van 1 uM) of 10X (voor acrylamide en waterstofperoxide, uitgaande van een maximale behandelingen van 100 mm en 10 mm, respectievelijk). Aanbevolen behandeling voorbereiding impliceert half-log (1: √ 10) seriële verdunning van de 250X compound in DMSO, gevolgd door verdunning in Compound verdunningsbuffer tot 10x (10x controle verbindingen van oorsprong uit dH 2 O kan direct serieel verdund worden in een steriele dH 2 O of samengestelde verdunningsbuffer). 10 pi van elke behandeling kan dan worden toegevoegd aan de 90 ul van cultuur media al aanwezig in elke goed, voor een laatste 1X concentratie (0,4% DMSO of 10% dH 2 O). Voorbeeld data is voorzien voor 24 of 96 uur van samengestelde behandeling bij 37 ° C voorafgaand aan de fixatie.
Cel fixatie en kleuring Immunofluorescente:
Let op: Kleuring tijd is ~ 2,5 uur na de fixatie. Sta niet toe dat bronnen om uit te drogen tussen de vlekken stappen. Aspiratie en bedeling van reagentia moeten worden uitgevoerd bij lage debieten aan een cel verlies als gevolg van vocht afschuiving verminderen. Alle aanbevolen 'per goed' volumes verwijzen naar een well van een 96-wells microtiterplaat. Alle aanbevolen 'per 96-well plaat' volumes onder meer 25% eigen risico voor liquid handling volume verlies. Alle vlekken stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT). Alle buffers en antilichaam-oplossingen zijn stabiel gedurende tenminste 24 uur bij RT.
- Aan het einde van de cultuur periode, pre-warm HCS Fixation Solution (2X) op kamertemperatuur (RT) of 37 º C, indien gewenst (12 mL/96-well plaat). In een chemische dampkap, voeg 100 ul / putje rechtstreeks aan cultuur media en laat fix voor 30 min bij RT. Verwijder fixatief / toxine bevattende media en verwijderen in overeenstemming met de regelgeving voor gevaarlijk afval (zie MSDS). Als procedure meteen voor vlekken, twee keer spoelen elk putje met 200 ul van HCS Immunofluorescentie Buffer. Als alternatief, als platen zijn te worden gemerkt op een later tijdstip, twee keer spoelen met 200 pi van Wash Buffer, dan laat seconden afspoelen volume in putten en op te slaan platen goed afgesloten bij 4 º C tot verkleuring.
- Als vaste monsters zijn opgeslagen bij 4 º C vóór de kleuring, twee keer spoelen met 200 pi HCS Immunofluorescentie buffer voordat u verder gaat met kleuringsprotocol.
- Bereid te werken oplossing van Rabbit Anti-βIII Tubuline / Mouse Anti-GFAP HCS Primaire antilichamen (6 mL/96-well plaat) als volgt: Voeg 60 ul van elk ontdooid primaire antilichaam tegen 5,88 mL van HCS Immunofluorescentie Buffer. Meng goed. Verwijder de vorige Immunofluorescentie Buffer spoelen. Voeg 50 ul van primaire antistof-oplossing in elk putje en incubeer 1 uur bij RT.
- Verwijder primair antilichaamoplossing. Spoel drie keer met 200 pi HCS Immunofluorescentie Buffer.
- Bereid te werken oplossing van HCS secundair antilichaam / Hoechst HCS Nuclear Stain (6 mL/96-well plaat) als volgt: 30 pi van elk ontdooid secundair antilichaam en 30 pi van de ontdooide Hoechst HCS Nuclear Stain tot 5,91 ml van HCS Immunofluorescentie Buffer. Meng goed, het beschermen van oplossing tegen licht. Verwijder de vorige HCS Immunofluorescentie Buffer spoelen. Voeg 50 ul van HCS secundair antilichaam / Hoechst HCS Nuclear Stain oplossing en incubeer gedurende 1 uur bij RT, beschermd tegen licht.
- Verwijder de HCS secundair antilichaam / Hoechst HCS Nuclear Stain oplossing. Spoel tweemaal met 200 pi HCS Immunofluorescentie Buffer.
- Verwijder de vorige HCS Immunofluorescentie Buffer spoelen. Spoel tweemaal met 200 pi van HCS Wash Buffer en laat seconden spoelen volume in putten.
- Afdichting plaat en beeld direct, of op te slaan plaat staan bij 4 º C beschermd tegen licht tot aan beeldvorming.
Image Acquisition and Analysis:
- Beeldvorming en analyse van de gekleurde platen kunnen worden uitgevoerd op een verscheidenheid van beschikbare HCS platforms, waaronder de IN Cell Analyzer (GE Healthcare), ArrayScan (ThermoFisher Scientific) en Opera (Perkin Elmer). Enkele richtlijnen voor beeldvorming en analyse zijn in Tabel 1:
| HCS222 Image Acquisition Richtlijnen | |||
| Detectie Reagens | Doelstelling Lens | Excitatiefilter Range [piek / bandbreedte (nm)] | Emissie Filter Range [piek / bandbreedte (nm)] |
| Hoechst HCS Nuclear Stain | 20X | 360/40 | 460/40 (of 535/50 indien nodig) |
| HCS tweede antilichaam, FITC-Donkey anti-konijn IgG | 20X | 480/40 | 535/50 |
| HCS tweede antilichaam, Cy3-Donkey anti-muis IgG | 20X | 535/50 | 600/50 |
HCS222 Image Analysis Richtlijnen | |||
| Cel Parameter | Opsporing | Segmentatie / meting | Motivering |
| Aantal cellen, Nucleaire Kenmerken | Hoechst HCS Nuclear Stain | Nucleair gebied (460 nm emissie kanaal). Tel het aantal kernen. DNA-inhoud (nucleaire intensiteit) of een nucleair gebied analyses zijn ook mogelijk. | Gebruik aantal cellen, de nucleaire kenmerken naar cel verlies, toxiciteit fenotypen, etc. vast te stellen kan "filter" kernen voor die in verband met βIII-tubuline of GFAP expressie te scheiden neuronale en astrocytaire celtellingen / karakteriseringen (sterk aanbevolen) te verkrijgen. |
| βIII-tubuline Expression, neurietuitgroei | HCS tweede antilichaam, FITC-geconjugeerd | Cytoplasmatische regio (535 nm emissie kanaal). FITC signaal kan worden gebruikt om de neuronale cellichamen onderscheiden van neurieten (bijvoorbeeld via minimum / gemiddelde cellichaam gebieden, minimum / maximum van neurieten lengtes en breedtes). Te bepalen parameters zoals het totale lengte van neurieten, neurieten telt / cel, etc. | Neurietuitgroei metingen kunnen gemoduleerd worden tijdens de neuronale differentiatie of als gevolg van chemische schade, ziekte staten, etc. Kan "filter" cellichamen voor die in verband met βIII-tubuline expressie aan verschillende neuronale karakterisering (sterk aanbevolen) te verkrijgen. |
| GFAP Expression, astrocyten omgeving | HCS tweede antilichaam, Cy3-geconjugeerd | Cytoplasmatische gebied (600 nm emissie kanaal). Cy3 signaal kan worden gebruikt om astrocytaire cytoplasmatische segmentatie te bepalen. Te bepalen parameters zoals de gemiddelde cytoplasmatische signaal intensiteit, cel oppervlakte, enz. | GFAP expressie en astrocyte cel-gebied kan gemoduleerd worden tijdens de astrocyten ontwikkeling of als gevolg van chemische schade, ziekte staten, etc. Kan "filter" cellichamen voor die in verband met GFAP expressie tot afzonderlijke astrocytaire karakterisering (sterk aanbevolen) te verkrijgen. |
. Tabel 1 Image Acquisition and Analysis Richtlijnen - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (Co-cultuur) Assay
Representatieve resultaten:
Figuur 1. βIII-tubuline en GFAP immunofluorescene van gemengde rat neurale celculturen.
Co-culturen van primaire rat hippocampus astrocyten met zowel primaire rat hippocampale neuronen of rat PC12 cellen werden gegenereerd door pre-plating astrocyten voor enkele dagen in de cultuur, gevolgd door de neuronale zaaien. Primaire neuronen werden gekweekt voor een extra 11 dagen, terwijl de PC12s werden gekweekt voor een extra 2 dagen onder differentiatie omstandigheden (lage serum / NGF). Cel behandeling, fixatie en immunokleuring werden uitgevoerd volgens HCS222 test protocollen. Cellen werden afgebeeld op de GE IN Cell Analyzer 1000 (punt 3.3) op 20X (primaire neuronen) of 10X (PC12) objectieve vergroting en geanalyseerd met behulp van de GE-IN Cell Analyzer 1000 Workstation (3.4) neurietuitgroei en Multi Target-analyse algoritmes Top paneel.: Fused beelden van Hoechst HCS Nuclear Stain (blauw), βIII-tubuline (groen) en GFAP (rood) fluorescentie. Afzonderlijke analyse van de βIII-tubuline fluorescentie kanaal zorgt voor neurietuitgroei segmentatie (middelste paneel: cellichamen beschreven in blauwe (primaire neuronen) of geel (PC12), neurieten in groen (primaire neuronen) of lichtblauw (PC12)). Analyse van de GFAP-kanaal zorgt voor astrocyten segmentatie (onderste panel: kernen beschreven in het blauw, cytoplasma in het groen). GFAP segmentatie voor de primaire rat hippocampal neuron / astrocyten co-cultuur toont het vermogen om onderscheid te maken tussen de kernen / cellichamen die GFAP (+) (groen contouren) en degenen die GFAP (-) (rood), waardoor aparte cel telt voor neuronen en astrocyten in een gemengde cultuur setting. 
Figuur 2. Dosis reacties van primaire rat hippocampal neuron / astrocyten co-culturen aan toxische stress.
Primaire rat hippocampus astrocyten (P6) werden uitgeplaat op 96-well platen in groei media en gekweekt voor 6 dagen. Primaire rat hippocampale neuronen (rechtstreeks van dooi) werden vervolgens gezaaid op de top van pre-plated astrocyten en gekweekt in groeimedia voor 11 dagen. Cellen werden behandeld met seriële verdunningen van acrylamide of waterstofperoxide (max. concentraties = 100mm en 10mm, respectievelijk) voor de laatste 24 uur van de cultuur. Cel behandeling, fixatie en immunokleuring werden uitgevoerd volgens HCS222 test protocollen. Cellen werden afgebeeld op de GE IN Cell Analyzer 1000 (punt 3.3) op 20X (10 velden / goed) en geanalyseerd (nucleaire / cytoplasmatische / neurieten segmentatie) met behulp van het GE IN Cell Analyzer 1000 Workstation (3.4) neurietuitgroei en Multi Target-analyse algoritmen. Gepresenteerde gegevens zijn gemiddelde ± SEM, n = 3. Meerdere parameters (neurietuitgroei, GFAP intensiteit, astrocyten gebied en neuronale of astrocytische-cel-tellingen) werden onderzocht voor de dosis-afhankelijke trends.
Discussion
Tot op heden hebben in vitro experimenten ontworpen om neurotoxiciteit risico-evaluatie met behulp van gemengde culturen van neuronen en astrocyten studie is beperkt. Het is goed aanvaard dat gliale cellen zijn integraal in het verstrekken van ruimtelijke en metabole ondersteuning aan neuronen, en spelen een cruciale rol bij het moduleren van verschillende neuronale functies, waaronder neuronale migratie, differentiatie en synaptische activiteit. Gliale astrocyten ook los cytokinen en andere oplosbare factoren die in staat zijn zowel induceren negatieve reacties in de omliggende neuronaal weefsel, alsmede de bevordering van neuronale tolerantie van de vele giftige stoffen. Demonstratie van de diepte van de neuronale-gliale interacties, in co-cultuur studies zijn astrocyten is aangetoond dat neuronen te beschermen tegen de toxiciteit van oxidatieve stress, terwijl de aantasting van astrocytaire functies, zoals het onderhoud van de anti-oxidant verdediging en cellulaire energie niveaus, is aangetoond dat kritisch invloed van neuronale overleving. Recente studies hebben gesuggereerd dat het gebruik van astrocyten in een in vitro neurotoxische test-systeem alleen kunnen blijken meer relevant zijn voor de mens centraal zenuwstelsel structuur en functie dan de neuronale cellen. Ondanks het groeiende bewustzijn van de fysiologische betekenis van de neuronale-astrocytaire interacties, is het eerder moeilijk om kwantitatieve analyses van deze interacties uit te voeren in intacte cellen. De komst van High Content Screening maakt de ontwikkeling van krachtige nieuwe assays aan te pakken dit.
In deze studie hebben we aangetoond dat kwantitatieve analyses van meerdere neuronale en astrocytaire fenotypen in een enkele assay worden mogelijk gemaakt door HCA. Bij primaire neuronen we hebben uitgevoerd kwantitatieve metingen van neurotoxiciteit merkers zoals neuronale nummer, neurieten tellen en neurieten lengte. In astrocyten, reactief gliosis is een bekende biomarker van neurotoxiciteit, gekenmerkt door veranderingen in GFAP expressie, astrocyten nummer en astrocyte morfologie. We hebben aangetoond dat elk van deze eindpunten gemakkelijk kunnen worden beoordeeld via HCA. Deze studies ondersteunen het concept dat HCA van neurale-specifieke biomarkers kunnen worden gebruikt als onderdeel van een reeks van in vitro-tests om snel het scherm een groot aantal chemicaliën voor neurotoxische eindpunten.
Millipore HCS222 Hoge Content Analysis kit voor co-cultuur van neuronen en astrocyten bestaat uit kwalitatief hoogwaardige detectie-reagentia en-protocollen voor het gelijktijdig profileren βIII-tubuline en gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) in een breed scala van cellulaire modellen van neurotoxiciteit. De zeer-gevalideerde reagentia, die bij deze kit kan de gebruiker testen te standaardiseren, test-to-assay variabiliteit te minimaliseren, en reproduceerbaar te genereren beelden met een hoge signaal-achtergrond verhouding.
Disclosures
De auteurs zijn alle medewerkers van Millipore Corporation.
Acknowledgments
De auteurs willen Drs bedanken. Rick Ryan, Umesh Patel, Jeff Till, Matthew Hsu, Jehangir Mistry en Michele Hatler voor ondersteuning tijdens de ontwikkeling van deze projecten en protocollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit Anti-βIII-Tubulin HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201672 | 1 vial containing 300 μL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| HCS Secondary Antibody (donkey anti-rabbit IgG, FITC conjugate), 200X | Part No. CS201649 | 1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| Mouse Anti-GFAP HCS Primary Antibody, 100X | Part No. CS201671 | 1 vial containing 300 μL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| HCS Secondary Antibody (donkey anti-mouse IgG, Cy3 conjugate), 200X | Part No. CS200437 | 1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| H–chst HCS Nuclear Stain, 200X | Part No. CS200438 | 1 vial containing 150 μL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| HCS Fixation Solution with Phenol Red, 2X | Part No. CS200434 | 1 bottle containing 100 mL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| HCS Immunofluorescence Buffer, 1X | Part No. CS200435 | 1 bottle containing 1000 mL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| HCS Wash Buffer, 1X | Part No. 2007643 | 1 bottle containing 500 mL Millipore HCS222 Kit Components |
|
| Acrylamide (Control Compound), 10X | Part No. CS201679 | 1 vial containing 500 μL of 1M acrylamide in dH2O Millipore HCS222 Kit Component |
|
| Hydrogen Peroxide (Control Compound), 10X | Part No. CS201730 | 1 vial containing 500 μL of 100 mM hydrogen peroxide in dH2O Millipore HCS222 Kit Components |
|
| K-252a (Control Compound), 250X | Part No. CS201741 | 1 vial containing 100 μL of 250 μM K-252a in DMSO Millipore HCS222 Kit Component |
|
| DMSO for Compound Serial Dilution | Part No. CS200441 | 1 bottle containing 10 mL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| Compound Dilution Buffer | Part No. CS200442 | 1 bottle containing 25 mL Millipore HCS222 Kit Component |
|
| Plate Sealers | Part No. CS200443 | 10 each Millipore HCS222 Kit Components |
|
| tissue culture-treated black/clear bottom microplates | |||
| HCS imaging/analysis system |
References
- Radio, N. M., Mundy, W. R. Developmental neurotoxicity testing in vitro: models for assessing chemical effects on neurite outgrowth. Neurotoxicology. 29, 361-376 (2008).
- Richards, G. R., Smith, A. J., Parry, F., Platts, A., Chan, G. K., Leveridge, M., Kerby, J. E., Simpson, P. B. A morphology- and kinetics-based cascade for human neural cell high content screening. Assay Drug Dev Technol. 4, 143-152 (2006).
- Evans, N. A., Facci, L., Owen, D. E., Soden, P. E., Burbidge, S. A., Prinjha, R. K., Richardson, J. C., Skaper, S. D. Abeta(1-42) reduces synapse number and inhibits neurite outgrowth in primary cortical and hippocampal neurons: A quantitative analysis. J Neurosci Methods. 175, 96-103 (2008).
- Breier, J. M., Radio, N. M., Mundy, W. R., Shafer, T. J. Development of a high-throughput screening assay for chemical effects on proliferation and viability of immortalized human neural progenitor cells. Toxicol Sci. 105, 119-133 (2008).
- Radio, N. M., Breier, J. M., Shafer, T. J., Mundy, W. R. Assessment of chemical effects on neurite outgrowth in PC12 cells using high content screening. Toxicol Sci. 105, 106-118 (2008).
- Harry, G. J., Tiffany-Castiglioni, E. Evaluation of neurotoxic potential by use of in vitro systems. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1, 701-713 (2005).
- Prockop, L. D. The allegory of a mountain: an environmental introduction to neurotoxicology. J Neurol Sci. 262, 7-14 (2007).
- Woehrling, E. K., Hill, E. J., Coleman, M. D. Development of a neurotoxicity test-system, using human post-mitotic, astrocytic and neuronal cell lines in co-culture. Toxicol In Vitro. 21, 1241-1246 (2007).
- Holden, L. J., Coleman, M. D. Assessment of the astrogliotic responses of three human astrocytoma cell lines to ethanol, trimethyltin chloride and acrylamide. Toxicology. 241, 75-83 (2007).
- Röhl, C., Lucius, R., Sievers, J. The effect of activated microglia on astrogliosis parameters in astrocyte cultures. Brain Res. 1129, 43-52 (2007).
- Eng, L. F., Ghirnikar, R. S., Lee, Y. L. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). Neurochem Res. 25, 1439-1451 (2000).
- Gadea, A., Schinelli, S., Gallo, V. Endothelin-1 regulates astrocyte proliferation and reactive gliosis via a JNK/c-Jun signaling pathway. J Neurosci. 28, 2394-2408 (2008).
- O'Callaghan, J. P., Sriram, K. Glial fibrillary acidic protein and related glial proteins as biomarkers of neurotoxicity. Expert Opin Drug Saf. 4, 433-442 (2005).
- Mead, C., Pentreath, V. W. Evaluation of toxicity indicators in rat primary astrocytes, C6 glioma and human 1321N1 astrocytoma cells: can gliotoxicity be distinguished from cytotoxicity? Arch Toxicol. 72, 372-380 (1998).
- Balls, M., Walum, E. Chapter 11: towards the acceptance of in vitro neurotoxicity tests. Neurotoxicology In Vitro. , Taylor and Francis. London. 269-283 (1999).
- Yokosuka, M., Ohtani-Kaneko, R., Yamashita, K., Muraoka, D., Kuroda, Y., Watanabe, C. Estrogen and environmental estrogenic chemicals exert developmental effects on rat hypothalamic neurons and glias. Toxicol In Vitro. 22, 1-9 (2008).
- Weible, M. W., Chan-Ling, T. Phenotypic characterization of neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and BMP4 to generate astrocytes. Glia. 55, 1156-1168 (2007).
- Casulari, L. A., Melcangi, R. C., Piva, F., Martini, L., Maggi, R. Factors released by rat type 1 astrocytes exert different effects on the proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) in vitro. Endocr Relat Cancer. 7, 63-71 (2000).
- Dringen, R., Gutterer, J. M., Hirrlinger, J. Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species. Eur J Biochem. 267, 4912-4916 (2000).
- Cristòfol, R. M., Gassó, S., Vílchez, D., Rodríguez-Farré, E., Sanfeliu, C. Neurotoxic effects of trimethyltin and triethyltin on human fetal neuron and astrocyte cultures: a comparative study with rat neuronal cultures and human cell lines. Toxicol Lett. 152, 35-46 (2004).
