在芽殖酵母中的自我复制寿命测量

Summary

在这篇文章中，我们提出了一个用于测量酵母母细胞的复制寿命一般协议。

Abstract

老化是一种退化性的过程，特点是逐渐恶化的细胞成分和细胞器造成的死亡率。芽殖酵母

Protocol

第1部分：准备株的复制寿命分析和板

本节介绍的复制寿命试验和酵母细胞寿命分析的准备使用固体YEPD板的准备。

1. 使用适当的消毒技术，，准备将用于培养酵母细胞和复制寿命分析的YEPD培养基琼脂平板（1％酵母提取物，细菌用2％的蛋白胨，2％琼脂，2％葡萄糖）。你应该准备至少2板寿命实验分析，每4-5株。板应准备至少2天前寿命试验，寿命试验开始前，允许干。如果实验内不会4-5天浇板发起的，他们应该被放置在冷藏孵化器，并在封口膜包裹或塑料，以防止dessication。
2. 删除从冻结的股票，到YEPD培养基琼脂平板上的单菌落连胜酵母菌株。截至6株可以很容易地在同一YEPD板挑染划分为同样大小的饼形楔板。
3. 2天，在30 ° C培养的细胞。
4. 删除到一个新的YEPD板的细胞的孵化器和修补细胞从一个单一的殖民地。两个补丁程序，从两个不同的菌落应为每一株产生。在这个时候，要分析的菌株，应进行编码，以确保复制寿命试验是“盲点”，其中的dissectors不知道个别菌株的身份。
5. 孵育30的补丁，编码细胞° C，直到第二天晚上。
6. 删除每个编码株的细胞和新鲜YEPD板轻轻修补细胞，这将作为复制寿命​​分析所用的实验板。应修补细胞沿着垂直线左侧YEPD板（图1）。约3-5％的补丁盘是最优的，假设月20日从每一个补丁细胞复制寿命分析。这是没有必要也不可取，转移大量的细胞，新鲜的YEPD板，因为这将导致细胞生长在厚厚的孵育过夜，这可能会限制随后将其复制寿命。
7. 孵育新鲜修补板台式过夜。

第2部分：位置细胞复制寿命分析。

在本节中，我们描述如何定位板的酵母细胞和如何获得维尔京子细胞复制寿命分析。从此时起，所有应parafilmed板，除了正在进行清扫时，为了防止dessication。

1. 使用酵母适合用显微切割设备配备一台显微镜，约50细胞从第一个修补应变转移到一个盘上远端修补细胞的位置。如果您的显微镜阶段等级，这些等级可以使用，以确保细胞将在随后的迭代中很容易找到。在蔡司Axioscope 40，从第一个修补应变细胞可以放置在坐标90 × 10和垂直排列从那里。
2. 清洁针反复接触琼脂表面的细胞，然后通过在琼脂孔针强行通过琼脂表面。这个洞将成为盘上在解剖和女儿细胞去除后续迭代作为东方您的标记。小心不要让酵母细胞中的孔，或他们成长，并能形成一个菌落。
3. 正上方的孔，垂直对齐个体酵母细胞为20个均匀分布的位置，与1-3针直径（〜100微米）之间的每个单元格的位置（图1）。每隔几个细胞，放置在相同的位置，而不是一个行的两个彼此相邻的细胞。这使得冗余在维尔京子细胞的选择，如果一个失败转移细胞划分。
4. 10 ^日和11 ^日行位置，创建一个水平的7-8孔的琼脂系列。这将作为一个板块在随后的迭代的解剖和女儿细胞去除标记东方您。小心不要让酵母细胞中的孔，或他们成长，并能形成一个菌落。
5. 重复步骤为每个盘上的补丁2.1-2.4，继续沿同一轴线垂直阵列细胞。步骤2.2中，创建的孔数应与补丁号（一杆进洞的第一个补丁，第二两个洞，等）。
6. 一旦细胞被排列为每个补丁，封口膜板和孵育30℃，约2小时。
7. 在实验中重复步骤每盘2.1-2.6。

第3部分：获取维尔京子细胞的寿命分析

在本节中，我们开始寿命分析，确保每一个细胞开始处女女儿细胞。

1. 从孵化器中取出的钢板和验证，大部分的摆着细胞都发生了细胞分裂。如果需要更多的时间来完成，让细胞分裂，返回板的孵化器。
2. 与第一摆着单元开始，用针轻轻地贴壁细胞上的针分离的子细胞从母细胞。它有时是非常有用挖掘显微镜底座的一边针细胞休息。
3. 将分离的子细胞中的垂直线，更换母细胞和任何其他的子细胞，并移动它们暂时搁置。
4. 为阵列的每个细胞，重复步骤3.2和3.3。如果一个细胞不分化，从一个多余的细胞定位在步骤2.3一个子细胞。完成时，你应该有20个细胞寿命板垂直对齐每个补丁的女儿。
5. 收集所有的母细胞和成桩的额外子细胞，他们转移到附近的一个面积的修补程序（“墓地”）。重要的是要保持远离细胞进行寿命分析，以防止形成microcolonies和当地的养分枯竭不需要的细胞。
6. 封口膜板和30 ° C孵育约2小时。
7. 在实验中重复步骤每盘3.2-3.6。

第4部分：测量单个细胞的复制能力

1. 准备寿命数据表。一个寿命数据表可以是一个简单的网格，每一行对应于一个单独的母细胞，每一列对应一个年龄点（图2）。标签每个数据表，根据要分析的菌株数。
2. 从孵化器中取出的钢板和验证摆着细胞大部分已经历了至少一个细胞分裂。如果需要更多的时间来完成，让细胞分裂，返回板的孵化器。
3. 从第一盘上的第一个摆着细胞，直观地观察母亲和女儿细胞（S），并确定已发生的细胞分裂数量。它通常是很容易确定母亲有多少女儿细胞产生的，基于特征的细胞安排模式。记录在适当的方格上的寿命评分表由母细胞产生的子细胞的数目。
4. 使用针分离的子细胞从母细胞，在步骤3.2中所述。
5. 保留其在垂直线的位置在母细胞和子细胞（S）移动暂时搁置。
6. 重复步骤4.3-4.5为阵列的每个细胞。
7. 收集所有的被丢弃的女儿细胞，将它们移动到“墓地”，原来的补丁附近。
8. 封口膜板和孵化在30 ° C时2-3小时。
9. 在实验中重复步骤每盘4.3-4.8。
10. 重复步骤4.2-4.9，直到所有的母细胞停止分裂。由于母细胞年龄，细胞周期进程变慢，这将是可取的孵化盘为年龄点之间的时间较长。板可放置在4 ° C过夜。

第5部分：代表性的结果。

一个复制的寿命实验中产生的原始数据列表中的数字对应每个母细胞产生的子细胞，在每个年龄段的点（图2）。通过总结评分表的每一行，每个母细胞复制寿命。可以汇集来自同一个实验组的母细胞的数据，生成一个生存曲线（图3A），并进行统计计算，如平均寿命，寿命中位数，和标准差，。可以执行一个非参数检验，如Wilcoxon秩和检验，以确定是否在寿命的显着性差异实验组之间的检测。当实验工作正常，生存曲线应大致与姜氏Makeham显示早期死亡率低的一个S形十八动力学一致的，在生存的较快下降的曲线的扁平化了后世。大多数野生型菌株跨度在20至30代的范围内复制生命值，虽然有报道此范围之外的变化。

图1。一个典型的复制寿命板图 。 3-5株，晚上开始酵母细胞显微切割前轻轻修补到一个YEPD板（红色框）在一条垂直线上的表面沿板的一侧。增长通宵之后，大约30个人从每一株细胞排列垂直插入一个包含20个职位。生命跨度analysiS将在V处女女儿从这些初始细胞获得的细胞。从显微切割（如不需要的子细胞）在实验过程中获得了额外的细胞被放置在“墓地”（灰色椭圆形），它位于远离细胞实验，以避免当地的养分枯竭殖民地形成。

图2。一个复制的寿命理货表从一个复制的寿命实验的原始数据 。所示。每一行对应一个单一的酵母母细胞和每一列对应一个年龄点。在每个方块中输入的数字是在这个年龄点，母细胞产生的子细胞的数目。每一株都带一个编码等个人剖析的酵母细胞有没有被分析菌株的身份的知识。 20细胞测定每一株。

图3。代表生存和生长曲线，从复制的寿命实验（一）生存曲线绘制母细胞的一小部分仍然活着的复制岁功能（细胞分裂的次数。获得（二）通过绘制生长曲线获得年龄点的功能作为一个给定的应变产生的子细胞的平均数目。，在这个例子中，＃2应变寿命更长，但增长较慢，所减少的增长曲线的初始斜率证明。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Reagent	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Bacto-Peptone	Reagent	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
Yeast Extract	Reagent	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)
Glucose