斑马鱼脑室注射液

Summary

神经管形成后，神经上皮收缩和皱褶而胚胎脑脊液（eCSF）形成的胚胎脑室管填充。我们开发这个脑室注射技术，以更好地可视化的充满液体的空间，相反，在一个活的胚胎神经上皮形状。

Abstract

正确的大脑心室形成胚胎大脑发育过程中是必需的正常的脑功能。脑室高度保守的大脑内充满脑脊液腔。在斑马鱼，神经管形成后，神经上皮经历了一系列的收缩和褶皱填充液体造成脑室形成。为了了解心室形成过程中，上皮形状的变化，在同一时间发生，我们需要一个方法来可视化脑组织相比，心室空间。然而，透明的斑马鱼胚胎的性质，使得它很难区分脑室空间组织。因此，我们制定了脑室注射技术脑室空间充满了一种荧光染料和明和荧光显微镜成像。明和荧光图像，然后处理，并在Photoshop中叠加。这种技术允许可视化与荧光染料心室的空间，比较明形象的神经上皮的形状。在斑马鱼的脑脑室注射可以采用18小时受精后通过早期的幼体阶段。我们已经广泛使用这种技术在脑室形成和形态发生的研究以及在脑的形态发生突变体（1-3）特征。

Protocol

协议

第1部分：准备显微注射

1. 准备使用萨特仪器针拉马拉毛细管针注射。
2. 用荧光染料（如得克萨斯州红葡聚糖）填写针。
3. 芒针在显微和显微注射器具。
4. 切成适当大小的针的角度，创建一个斜角提示。
5. 测量液滴大小，并检查它每注入1 - 2nl之间的石油。

第2部分：准备胚胎

1. 注入30分钟，比利益阶段的早期胚胎。例如，要研究在受精后24小时（HPF）的心室，注入胚胎23.5 HPF。根据金梅尔等阶段的胚胎。 （4）。
2. 在立体显微镜下，从胚胎的使用镊子小心取出的绒毛。
3. 使用涂有1％的琼脂糖一个塑料盘，用塑料1-200微升枪头戳孔在琼脂糖。从孔，使用镊子小心取出琼脂糖插头。
4. 在胚胎媒体的胚胎转移到有孔的琼脂糖菜。
5. 添加tricaine（韦斯特（5）根据）向媒体麻醉的胚胎，并防止在实验过程中的运动。
6. 胚胎尾巴轻轻将入孔，和东方它使胚胎后注射器具。

第3部分：注射脑室

1. 要注入脑室，安排，使针尖在同一领域的高功率的胚胎的显微操作设置。
2. 没有击中下方的脑组织通过后脑后r0/r1 hingepoint薄roofplate小心翼翼地把针头。
3. 注入足够的染料完全填补心室。这可能需要几针，以填补心室的空间，取决于胚胎阶段。

第4部分：成像

1. 使用干净的1％琼脂糖涂层盘，在盘子里戳的新的漏洞，取出插头，并添加tricaine麻醉胚胎，防止运动。
2. 脑室注射胚胎的尾巴放入孔和一个背影像的位置。
3. 使用透射光拍摄图像。
4. 这是非常关键的不动的胚胎或显微镜。
5. 更改的设置，在显微镜图像，并采取荧光灯。
6. 重新定位的胚胎采取横向与透射光荧光灯图像。
7. 另存为TIFF文件在Photoshop图像处理的图像。

第5部分：图像处理

1. 要在Photoshop中处理图像，打开透射光荧光灯图像，并在同一位置上采取相同的胚胎。确保所有的设置都为每个图像相同。
2. 拖到您的荧光图像和透射光图像完全一致。
3. 随着荧光图像选择，选择“图像”，“调整”，然后在“替换颜色”，改变的黑色背景为白色。
4. 在“替换颜色”窗口中的“模糊性”因素调整的权利，直到荧光图像看起来颜色均匀一致。
5. 在“图层”窗口，选择“乘”，以查看叠加图像。脑室空间影像透射光图像完全匹配。
6. 任何其他图像保存这个文件，然后重复。

代表性的成果/成果

正确的脑室注射图像显示在图1面板广告，例如不正确的注射图像显示在EH的。正确的注射有锋利的边缘和非弥漫性染料。不正确的注射，发生当针插入太远入脑室，点击下面的脑组织，可导致脑室空间的外部可见的染料和蛋黄。

图1。脑室注射25 HPF野生型胚胎 （AD）的正确的注射方法（EH）的不正确的注射方法作为例子所示。 （A，E）与相应的荧光图像背明图像（B，F）和荧光和明图像叠加显示正确和不正确的注射方法（C，G）。箭头指示染料已经超越了脑室空间，由于一个不正确的脑室注射（见“故障排除”）地区。眼前是所有图像左侧。

故障排除：

问题原因	补救
您是挤压针的胚胎。	你的针太钝或尖太大。	开始一个新的针，不打破它早。锥您像一个注射器针头锋利的针。
染料整个胚胎和蛋黄（见图1E - H）。	通过组织您的针去，并没有停留在脑室空间。	你的针头可能没有足够锋利，所以你无法控制穿刺的速度。
这种染料是太微弱或没有前脑。	您没有使用一个足够高的注射压力，或你的针是远远不够前到达前脑，当你注入染料。	增加注射压力或放置针在注射前略多。如果需要更详细的是前脑的，你可以把针通过中脑，后脑边界。您也可以简单地等待染料位前成像进一步弥漫。
您的荧光图像在Photoshop中的颜色替换后的边缘周围的黑暗。	你忘了，改变“颜色替换”窗口中的“模糊性”设置。	移动的“模糊性”的“颜色替换”窗口中的权利的方式。
中针会不会穿刺后脑roofplate。	你的针是不正确的削减。	创建一个新的针。如果你是做了很多注射，您可能需要几针，因为他们可以得到沉闷。

Discussion

在这段视频中，我们演示了如何注入荧光染料（得克萨斯州红葡聚糖），斑马鱼脑室。这种方法是用来在脑室周围神经上皮空间可视化，并确定脑室空间的形状以及周围脑组织的形状是非常有用。它使我们能够更好地了解脑室形成，随着时间的推移活胚胎脑的形态发生过程。这项技术是一个极好的工具，为研究脑室形成缺陷和脑的形态发生突变体的初步鉴定和研究。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	Tool	Fine Science Tools	11252-20
Capillary Tubes (needles)	Tools	Frederick Haer and Co.	30-30-1
Agarose-Coated dishes	Tools	Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning)	Agarose (50027) Dishes (430166)	Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting
Dissecting Microscope	Microscope	Carl Zeiss, Inc.
Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software	Tools
1-200 μ pipette tips	Tools	USA Scientific, Inc.	1111-0806	These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly.
Photoshop	Image Analysis	Adobe
Embryo Loop	Tools			Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax.
Microinjector	Tools	Harvard Apparatus	PL1-100
Needle Puller	Tools	Sutter Instrument Co.		Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70).
Micromanipulator	Tools	Narishige International
Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW	Reagent	Molecular Probes, Life Technologies	D1830	Other Molecular weights are available if desired.
Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester)	Reagent	Sigma-Aldrich	A-5040
Embryo Media	Reagent			According to Westerfield (5)