Summary
GFP融合蛋白被广泛应用于共聚焦显微镜可视化的细胞器。然而，筛选突变，影响细胞器的形态一般需要个人的突变，非常耗时。在这里，我们展示了一种方法，同时结合近5000个非必要基因在酵母细胞器- GFP标记。
Abstract
高通量的方法研究蛋白质的本地化或细胞器的形态，是研究蛋白质相互作用的有效工具，并能够帮助实现的分子途径全面了解。在酿酒酵母中，与非必需的基因缺失阵列发展，我们可以在全球范围研究的形态不同的细胞器如内质网（ER）和线粒体使用GFP（或变种）的标记在不同的基因背景。然而，在每一个单一的突变体含有绿色荧光蛋白标记单独是一个劳动力密集的过程。在这里，我们描述了，经常是在我们的实验室中使用的程序。我们可以通过使用一个机器人系统来处理的高密度的酵母阵列和药物筛选技术，大大缩短所需的时间，提高可重复性。总之，我们穿过一个GFP标记的线粒体标记（Apc1 GFP）的机器人副本寄托到4672不必要的基因缺失突变体的高密度阵列。通过二倍体选择，孢子形成，萌发和双标记选择，我们收回这两个等位基因。因此，每个单倍体单突变包含Apc1 - GFP在其基因组位点中。现在，我们可以研究线粒体的形态在所有非必要的突变背景。使用这种高通量的方法，我们可以方便地研究和划定的途径，并在继承和细胞器的形成，在全基因组的设置有关的基因。
Protocol
材料和方法：
- 酵母菌株：
- ACP1 - GFP（绿色荧光蛋白：）：C -末端标记GFP的ACP1生成一个使用（包含GFP和HIS5）质粒pKT128 PCR介导的同源重组。共聚焦显微镜和菌落PCR确认阳性转化。应变背景BY7043（MAT阿尔法can1Δ：STE2pr lue2lyp1Δhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0）从布恩实验室（塘和Boone，2006年）。
- 缺失突变体阵列（DMA）（XXX：：KanR）：它是一个非必需基因的缺失突变体约5000的数组。所有这些不必要的基因被淘汰的G418的。数组的应变背景BY4741（MATA his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0）。我们的DMA最初是从布恩实验室。
- 纳入ACP1 - GFP在DMA：
以下协议GFP的阵列是改编自合成的遗传分析（SGA）的技术与修改（塘和Boone，2006）。所有副本寄托的步骤是通过使用一个歌手转子高密度阵列的机器人系统。另外，手册寄托或液体的高密度组阵机器人可以使用。
缩略语：YPD，酵母提取物，蛋白胨，葡萄糖，SD，合成辍学; LRK，略/精氨酸/赖氨酸辍学媒体; LHRK，略/他/精氨酸/赖氨酸辍学媒体
制备- 增长到YPD板浇筑5毫升的通宵ACP1 - GFP的文化ACP1 - GFP细胞的草坪。允许板充分干燥火焰或在生物通风柜。
- 在30˚C过夜孵育板。
- 到1536菌落每盘使用一个机器人，阵列ACP1 - GFP的应变。与此同时，准备一个新鲜的DMA副本，副本寄托YPD + G418的板。
- 在30˚C过夜培养板。
交配和二倍体选择 - 伴侣的副本寄托和铺设YPD板的殖民地ACP1 - GFP与DMA应变。
- 在30˚C过夜培养板。
- 副本板的殖民地上的SD - 他+ G418的板选择二倍体细胞（马塔/ MATalpha）。
- 在30˚C过夜培养板。
Sporulationg和萌发 - 副本板关于加强产孢媒体二倍体殖民地，其中包含碳和氮的来源的水平下降，诱发减数分裂孢子的形成。
- 在25˚C的最少5天的孵育板。
- 发芽副本电镀到LRK媒体的殖民地的马塔减数分裂后代和孵化板块在30˚C为两天。
- 这媒体会诱发单倍体细胞从孢子萌发。由于LUE2开放阅读框（ORF）是集成在特定的马塔STE2发起人，将所有的单倍体发芽MATA。
两个等位基因的选择 - 现在有必要选择的绿色荧光蛋白基因和单个突变的等位基因。而要做到这一点，马塔细胞副本镀上LRK + G418的媒体 ，单倍体细胞，进行基因缺失（XXX：：kanR）选择。
- 在30˚C过夜培养板。
- 最后，MATA减数分裂后代副本镀上LHRK + G418的媒体选择增长的单突变体（XXX：kanR：），也窝藏ACP1 - GFP（绿色荧光蛋白：：他的） 。这些板块可以存储在4˚彗星为3个月。
以下协议GFP的阵列是改编自合成的遗传分析（SGA）的技术与修改（塘和Boone，2006）。所有副本寄托的步骤是通过使用一个歌手转子高密度阵列的机器人系统。另外，手册寄托或液体的高密度组阵机器人可以使用。
缩略语：YPD，酵母提取物，蛋白胨，葡萄糖，SD，合成辍学; LRK，略/精氨酸/赖氨酸辍学媒体; LHRK，略/他/精氨酸/赖氨酸辍学媒体
制备 - 显微镜：
- 选取所需的突变体（S），表示从盘直接ACP1 - GFP。
- 细胞增长在30 ° C在YPD或SD - 早期日志阶段他的媒体。
- 可视化共聚焦显微镜使用的GFP filterset。预期结果的一个例子是在图1示出。
SGA的媒体：
在本议定书中使用的生长介质（YPD）和选择媒体（SD）是经常使用的酵母分子生物学。请参考方法在酵母中的详细说明（安伯格等，2005年）。
LRK，LHRK媒体（400毫升总量）
| 为了添加 | 金额 |
| 硫酸铵酵母氮肥基地 | 2.7摹 |
| 氨基酸组合 | 0.8摹 |
| 洋菜 | 8 g的 |
| DH 2 O | 360毫升 |
| 高压灭菌器 | |
| 20％葡萄糖 | 40毫升 |
| 冷却至65˚彗星 | |
| 100毫克/毫升刀豆 | 0.2毫升 |
| 100毫克/毫升thialysine | 0.2毫升 |
| 混合，倒入50毫升每盘 | |
LRK，LHRK + G418的媒体（400毫升总量）
| 为了添加 | 金额 |
| 没有硫酸铵酵母氮肥基地 | 0.7摹 |
| 氨基酸组合 | 0.8摹 |
| 味精 | 0.4 |
| 洋菜 | 8 g的 |
| DH 2 O | 360毫升 |
| 高压灭菌器 | |
| 20％葡萄糖 | 40毫升 |
| 冷却至65˚彗星 | |
| 100毫克/毫升刀豆 | 0.2毫升 |
| 100毫克/毫升thialysine | 0.2毫升 |
| 200 mg / ml的G418 | 0.4毫升 |
| 混合，倒入50毫升每盘 | |
富含孢子媒体（400毫升总量）
| 为了添加 | 金额 |
| 醋酸钾 | 4摹 |
| 酵母提取物 | 0.4摹 |
| 葡萄糖 | 0.2克 |
| 产孢氨基酸酸混合 | 0.04摹 |
| 洋菜 | 8 g的 |
| DH 2 O | 360毫升 |
| 高压灭菌器 | |
| 冷却至65˚彗星 | |
| 200 mg / ml的G418 | 0.4毫升 |
| 混合，倒入50毫升每盘 | |
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Discussion
这种方法可以帮助有效地纳入各种突变的背景线粒体标记，ACP1 - GFP。它依赖于使用的机器人系统，并且可以很容易地通过使用任何机器人系统。此过程也可用于包含其他类型的标记。例如，可视化ER，我们经常使用的标记Erg11 - GFP。在我国有代表性的图片，一个突变体和野生型与ACP1 - GFP的制造商visualiz海关共聚焦显微镜研究线粒体的形态。扰乱线粒体突变体的表型，因此是一个很好的候选人作进一步调查。
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Acknowledgments
这项工作是支持的生物技术和生物科学研究理事会（批31/C15982），加拿大卫生研究院，加拿大，不列颠哥伦比亚省知识发展基金，创新基金的迈克尔史密斯健康研究基金会（授予民事司法制度改革雄狮），并为视力扑灭。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SGA media | The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions. |
References
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).
- Tong, A. H., Boone, C. Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 313, 171-192 (2006).
