Summary
HC11 лактогенный дифференциации можно охарактеризовать образование куполообразных сооружений, которые упоминаются как mammospheres. Структуры могут быть перечислены по фазе микроскопии отличие от помощи в количественном лактогенный дифференциации.
Abstract
Фенотипические мера обычно используется для определения степени дифференциации в лактогенный молочной железы мыши эпителиальных клеточных культур является формирование куполообразной формы клеточных структур называют mammospheres
Protocol
- HC11 клетки были выращены до слияния в течение 6 дней в RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 5μg/ml Инсулин, 10 мМ HEPES, 10ng/ml эпидермального фактора роста (ЭФР) для установления компетенции.
- Клетки промывали PBS и поддерживается в средствах массовой информации без роста EGF в течение 24 часов.
- Для стимулирования лактогенный дифференциации клетки инкубировали в дифференциации средств массовой информации, то есть RPMI с дексаметазоном (10 -6 М), инсулин (5 мкг / мл) и пролактин (5 мкг / мл) называют DIP.
- В установленное время после DIP того, mammospheres были сфотографированы и перечисленные фазового контраста микроскопии с использованием Olympus IX71 микроскоп с цифровой камерой.
Представитель Результаты:
Низкий увеличение мощности нормального эпителия молочной монослоя клеток и несколько mammospheres, а также большом увеличении мощности одной mammosphere показаны на рисунке 1, соответственно. 
Рисунок 1. Mammospheres. () Нормальный молочной эпителиальных монослоев ячейки должно быть показано, как плоский слой вырожденных клеток. (Б) После 3-5 дней DIP стимуляцию нескольких mammospheres появляются. Фотография сделана 5 дней после того DIP. (С) Высшее увеличение одного поля, содержащего mammospheres на 5 дней после того DIP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для того, чтобы эту технику, чтобы быть успешным и самого лучшего качества, эпителиальные клетки должна поддерживаться на уровне слияния до того, как индуцированные лактогенный гормонов. Там могут быть ситуации, когда Есть множество mammospheres, что делает количественного трудно. Таким образом, для количественных целей лучше всего фотографировать mammospheres на момент времени, когда число mammospheres может быть подсчитаны.
Хотя Есть различные молекулярные маркеры используются для определения степени лактогенный дифференциации эпителиальных клеток молочной, Есть несколько морфологических маркеров для клеток, выращенных в 2D культуры. Способность эпителиальных монослоев ячейки форме миниатюрные структуры купола, где молочные белки могут накапливаться обеспечивает режим, который морфологические изменения, которые происходят во время этого процесса развития могут быть отслежены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Средства от Конгрессом Режиссер медицинских исследований Фонда грант (DAMD17-01-0264) к М. Л. Катлер и Соединенными Штатами военного института рака в ML Катлер поддерживается работа.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Invitrogen | 21870076 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Hepes | Quality Biological, Inc. | 118089060 | |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585-014 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Digital Camera | QImaging | Retiga 2000RV Fast 1394 |
References
- Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells. Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).
- Wang, W. Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells. J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).
