Summary
HC11 lactogenic Differenzierung kann durch die Bildung von Kuppelbauten genannt mammospheres charakterisiert werden. Die Strukturen können durch Phasenkontrast-Mikroskopie aufgezählt werden, um bei der Quantifizierung lactogenic Differenzierung zu unterstützen.
Abstract
Eine phänotypische Maßnahme häufig verwendet, um den Grad der Differenzierung in lactogenic Maus Brustepithelzellen Zellkulturen zu bestimmen, ist die Bildung von kuppelförmigen Zellstrukturen genannt mammospheres
Protocol
- Die HC11 Zellen wurden bis zur Konfluenz für 6 Tage in RPMI 1640 Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 5μg/ml Insulin, 10 mM HEPES, 10ng/ml epidermal growth factor (EGF), um Kompetenz zu etablieren ergänzt gewachsen.
- Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und gepflegt in Nährmedien ohne EGF für 24 Stunden.
- Zur Induktion lactogenic Differenzierung wurden die Zellen bei der Differenzierung Medien, dh RPMI mit Dexamethason (10 -6 M), Insulin (5 ug / ml) und Prolaktin (5 ug / ml) genannt DIP inkubiert.
- Bei den angegebenen Zeiten post-DIP Zusätzlich wurden mammospheres fotografiert und aufgelistet durch Phasenkontrast-Mikroskopie mit einer Olympus IX71-Mikroskop mit Digitalkamera.
Repräsentative Ergebnisse:
Geringe Leistungsaufnahme Vergrößerung der normalen Brustepithelzellen Zellmonoschichten und mehrere mammospheres sowie hohe Leistung Vergrößerung eines einzelnen mammosphere sind in Abbildung 1 gezeigt. 
Abbildung 1. Mammospheres. (A) Normal Brustepithelzellen Zellmonoschichten sollte als eine flache Schicht von konfluenten Zellen angezeigt werden. (B) Nach 3-5 Tagen der DIP Stimulation mehrerer mammospheres erscheinen. Foto genommen 5 Tage nach der DIP hinaus. (C) Höhere Vergrößerung eines einzelnen Feld mit mammospheres bei 5 Tage nach der DIP hinaus.
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Discussion
Um für diese Technik erfolgreich zu sein und von bester Qualität, die Epithelzellen sind bei Konfluenz gehalten werden, bevor die mit lactogenic Hormone induziert. Es kann Situationen geben, wo es zahlreiche mammospheres, die die Quantifizierung erschwert werden. So quantitative Zwecke ist es am besten, die mammospheres zu einem Zeitpunkt fotografieren, wenn die Zahl der mammospheres kann gezählt werden.
Zwar gibt es verschiedene molekulare Marker verwendet werden, um den Grad der Differenzierung der lactogenic Brustepithelzellen bestimmen sind, gibt es einige morphologische Marker für Zellen in 2D Kultur gewöhnt. Die Fähigkeit der epithelialen Zell-Monolayer zu Miniatur-Kuppel Strukturen, in denen Milch Proteine akkumulieren Form bietet einen Modus, mit dem die morphologischen Veränderungen, die während dieses Entwicklungsprozesses auftreten überwacht werden können.
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Acknowledgments
Funds from vom Kongress Regie Medical Research Fund gewähren (DAMD17-01 bis 0264) zu ML Cutler und United States Military Cancer Institute zu ML Cutler unterstützte die Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Invitrogen | 21870076 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Hepes | Quality Biological, Inc. | 118089060 | |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585-014 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Digital Camera | QImaging | Retiga 2000RV Fast 1394 |
References
- Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells. Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).
- Wang, W. Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells. J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).
