Summary
HC11 lactogenic farklılaşma mammospheres olarak anılacaktır kubbeli yapıların oluşumu ile karakterize edilebilir. Yapılar, faz kontrast mikroskobu ile numaralandırılan lactogenic farklılaşma niceleme yardımcı olabilir.
Abstract
Fare meme epitel hücre kültürlerinde lactogenic farklılaşma derecesini belirlemek için yaygın olarak kullanılan fenotipik önlem mammospheres olarak anılacaktır kubbe şeklinde hücre yapılarının oluşması.
Protocol
- HC11 hücreleri RPMI 1640 orta ve% 10 fetal sığır serumu, 5μg/ml İnsülin, 10 mM HEPES, yetkinlik kurmak için 10 ng epidermal büyüme faktörü (EGF) ile desteklenmiş 6 gün izdiham büyüdü.
- Hücreler PBS ile yıkanır ve 24 saat için EGF olmadan büyüme ortamı muhafaza edildi.
- Lactogenic farklılaşma ikna etmek için hücre farklılaşması medya, yani RPMI deksametazon (10 -6 M), insülin (5 mg / ml) ve prolaktin (5 mg / ml) olarak DIP atıfta inkübe edildi.
- Belirtilen kez post-DIP Ayrıca, mammospheres fotoğrafları çekildi ve bir dijital fotoğraf makinesi ile Olympus IX71 mikroskop kullanılarak faz kontrast mikroskobu ile numaralandırılan.
Temsilcisi Sonuçlar:
Düşük güç büyütme, normal meme epitel hücre mono tabakaları ve birden fazla mammospheres yanı sıra, tek bir mammosphere yüksek güç büyütme, sırasıyla, Şekil 1'de gösterilmiştir. 
Şekil 1. Mammospheres (a) Normal meme epitel hücre mono tabakaları konfluent hücrelerinin düz bir tabaka olarak görüntülenmesi gerekir. (B) DIP stimülasyon 3-5 gün sonra birden fazla mammospheres görünür. Fotoğraf 5 gün DIP Ayrıca yazılan. (C) DIP Ayrıca yazılan 5 gün mammospheres içeren tek bir alanda Yükseköğretim büyütme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Amacıyla bu tekniğin başarılı olmak ve en iyi kalite, epitel hücreleri lactogenic hormonları ile indüklenen önce izdiham muhafaza edilmelidir. Ölçülmesi zor kılan pek çok mammospheres vardır durumlar olabilir. Böylece, kantitatif amaçlar için mammospheres sayısı sayılacak bir zaman noktasında mammospheres fotoğraflamak için en iyisidir.
Meme epitel hücrelerinin lactogenic farklılaşma derecesini belirlemek için kullanılan çeşitli moleküler belirteçlerin bulunmasına rağmen, 2D kültür yetiştirilen hücreler için kullanılan birkaç morfolojik belirteçleri vardır. Süt proteinleri birikebilir minyatür kubbe yapıları oluşturmak için epitel hücre mono tabakaları yeteneği bu gelişim süreci sırasında meydana gelen morfolojik değişiklikler izlenebilir hangi bir mod sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Congressionally Yönetmen Tıbbi Araştırma Fonu hibe (DAMD17-01-0264) ML Cutler ve ML Cutler Amerika Birleşik Devletleri Askeri Kanser Enstitüsü Fonları çalışmaları destekledi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI | Invitrogen | 21870076 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| PenStrep | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Hepes | Quality Biological, Inc. | 118089060 | |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585-014 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Digital Camera | QImaging | Retiga 2000RV Fast 1394 |
References
- Blatchford, D. R., Hendry, K. A., Turner, M. D., Burgoyne, R. D., Wilde, C. J. Vectorial secretion by constitutive and regulated secretory pathways in mammary epithelial cells. Epithelial Cell Biol. 4, 8-16 (1995).
- Wang, W. Glucocorticoid induced expression of connective tissue growth factor contributes to lactogenic differentiation of mouse mammary epithelial cells. J Cell Physiol. 214, 38-46 (2008).
