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Biology

Geração de Single-Cell Tissue Suspensões de rato Neural

doi: 10.3791/1267 Published: July 7, 2009

Summary

Dissociar as células de tipos de tecido específico requer parâmetros específicos para aggitation tecido para obter um volume elevado de viáveis, as células cultiváveis. A Miltenyi gentleMACS Dissociator otimiza essa tarefa com um protocolo simples e prática. Nesta publicação o uso deste aparelho no tecido nerual é explicado.

Abstract

Dentro do sistema nervoso, centenas de tipos de células neuronais e gliais têm sido descritas. Cada tipo específico de célula no cérebro ou na medula espinhal tem um repertório de moléculas da superfície celular, ou determinantes moleculares, através do qual podem ser identificados e caracterizados. Atualmente, a identificação de células robustas e tecnologias de separação exige uma única célula preparações a serem gerados ao mesmo tempo, limitar a morte celular e destruição de proteínas de superfície característicos. O Dissociator gentleMACS, quando usado em combinação com tripsina ou kits papaína baseado dissociação, pode efetivamente e gentilmente dissociar o tecido cerebral, preservando epítopos do antígeno e limitar a perda de células. Preparação padronizada de uma única célula suspensões é conseguido usando Tubos C e otimizado, programas predefinidos gentleMACS. Uma vez gerados, de uma única célula suspensões podem ser tratados com conjugados monoclonais como Anti-Prominin-1 microesferas, que identificam progenitores neurais, ou purificado ainda mais usando Beads Remoção de mielina.

Protocol

Para trabalhar em condições estéreis, é recomendada a realização de todas as etapas em uma capela de fluxo laminar.

1. Materiais

  • Neurais Tissue dissociação Kit (P) (Componentes: Solução 1,2, 3 e 4, buffer de armazenamento)
  • Separação pré-filtros
  • (Opcional) Remoção Beads Mielina
  • Beta-mercaptoetanol
  • gentleMACS Dissociator
  • C Tubes
  • MACSmix Rotator Tubo
  • HBSS (w / o)
  • HBSS (w)
  1. Preparar as soluções seguintes antes de começar o protocolo:
    1. Solução Hanks 'Salt Buffered sem cátions divalentes Ca 2 + ou Mg 2 + (HBSS (w / o)
    2. HBSS, standard, ou seja, com Ca 2 + e Mg 2 + (HBSS (w)
  2. Dependendo do epítopo do antígeno de interesse em aplicações subseqüentes, use o papaína baseado Neural Tissue dissociação Kit (P) ou o Tripsina baseado Neural Tissue dissociação Kit (T).
  3. Prepare as seguintes soluções a partir da dissociação Neural Tissue Kit:
    1. Solução 2: adicionar beta-mercaptoetanol para 0,067 mM
    2. Solução 4: dissolver o pó em 0,7 ml de buffer de armazenamento (fornecido no kit), misture delicadamente (não vortex)
    3. Mix de enzimas 1: Pipetar 1,9 mL da solução 2 e 50 mL da solução 1 (ambos do kit) em um tubo C e incubar por 10-15 min a 37 ° C. Isto é suficiente para dissociar 400 mg do tecido cerebral.

2. Dissociar o tecido neural

  1. Pesar tecido cerebral em um tubo contendo 1 ml HBSS (w / o)
  2. Transferência do cérebro do rato no tubo C contendo 1950 mL da mistura de enzimas pré-aquecido 1. (NOTA: este protocolo é escrito para ≤ 400 mg, mas os volumes solução pode ser dimensionada para acomodar até 1.600 mg de tecido cerebral por metro C)
  3. Coloque o tubo C para a Dissociator gentleMACS e executar o programa "m_brain_01".
  4. Incube com a rotação (4 rpm usando um tubo Rotator MACSmix) por 15 min a 37 ° C.
  5. Coloque o tubo C para a Dissociator gentleMACS e executar o programa "m_brain_02".
  6. Durante a etapa de dissociação preparar 30 mL da mistura de 2 por Enzyme 400 mg de tecido por gentilmente mistura de 20 ml de solução-3 e 10 ml de solução 4.
  7. Adicionar Mix Enzyme 2 para o tubo C através do septo, selada tampa e misture delicadamente sem vórtex.
  8. Incubar o tubo C com rotação de 10 min a 37 ° C em uma incubadora.
  9. Coloque o tubo C para a Dissociator gentleMACS e executar o programa "m_brain_03".
  10. Incubar o tubo C com rotação de 10 min a 37 ° C em uma incubadora.
  11. Centrifugar brevemente para coletar a amostra no fundo do tubo.

3. Filtração

  1. Selecione um filtro grande o suficiente para permitir a passagem para as células de interesse. Por exemplo, células de Purkinje são demasiado grandes para passar através de um filtro M 30, mas Prominin-1 + células vontade.
  2. Use uma pipeta suitable1000 mL para remover as células formam o tubo C através do septo, selada tampa e aplicá-lo para o Filtro de pré-separação em um tubo de coleta de 15 ml. (NOTA: para tamanhos de amostra maior uso de um tubo de coleta de 50 ml).
  3. Lavar o filtro com 10 ml de HBSS (w).
  4. Centrifugar as células filtradas a 300 xg por 10 min em temperatura ambiente.
  5. Ressuspender o sobrenadante em seu meio ou tampão de escolha para aplicações subseqüentes.
  6. Para remover os restos de mielina, use Beads Remoção de mielina.

4. Resultado representante: Por favor Veja as Figuras 1-3

fig 1
Figura. Uma dissociação O cérebro com o Dissociator gentleMACS resultou em 97% de células viáveis, como mostra a análise por citometria de fluxo.

fig 2
Figura. 2 imagem do microscópio de luz de formação neurosphere após separação de células magnéticas usando Anti-Prominin-1 microesferas após 7 dias de cultivo em MACS ® NeuroMedium suplementado com MACS suplemento B27 PLUS. Células foram preparados a partir de cérebro de camundongos CD1 (P3), utilizando o Neural Tissue dissociação Kit (P).

fig 3,5
Figura. Três fragmentos de mielina em uma única célula suspensões prejudica consideravelmente o isolamento de células e remoção de detritos de mielina por Beads Remoção de mielina aumenta a eficiência das células separações. Para MACS Separações usando Anti-Prominin-1 micro, P22 cérebro do rato era dissociado usando o Neural Tissue dissociação Kit (P). Células da suspensão de uma única célula foram diretamente usados ​​para a separação, ou foram submetidos a mielina esgotamento usando Beads Remoção de mielina. Comparando-se a separação de amostras sem e com a remoção de mielina, demonstra que a pureza é maior para as amostras com a remoção de mielina anterior.

Discussion

O Dissociator gentleMACS facilita a preparação padronizada de uma única célula suspensões de tecidos neurais em um sistema fechado. Kits tecido neural dissociação são otimizados para preservar epítopos de antígeno necessária para outras aplicações como reações imunoistoquímicas e separação de células imunomagnética 1-5. Neste protocolo, mostramos a dissociação gentil enzimática de cérebro de camundongo usando o Dissociator gentleMACS eo Neural Tissue dissociação Kit (P), resultando em 97% de células viáveis. 100 mg de rendimentos tecido neural entre 5x10 6 e 1x10 7 células, dependendo da idade do tecido hospedeiro. O alvo células Prominin-1 + foram isoladas usando Anti-Prominin-1 micro e posteriormente levados em cultura. O protocolo é mostrado para ser ainda mais eficaz com o uso adicional de Contas Remoção de mielina quando se trabalha com tecido neural derivado de ratos P7>.

Disclosures

Os autores são funcionários da Miltenyi Biotec GmbH, Alemanha.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C Tubes Miltenyi Biotec Order no. 130-093-237 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
gentleMACS™ Starting Kit Miltenyi Biotec Order no. 130-093-235 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
MACSmix™ Tube Rotator Miltenyi Biotec Order no. 130-090-753 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx
Neural Tissue Dissociation Kit (P) Miltenyi Biotec Order no. 130-092-628 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec Order no. 130-041-407 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
Anti-Prominin-1 MicroBeads Miltenyi Biotec Order no. 130-092-333 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx
Anti-Prominin-1-APC Miltenyi Biotec Order no. 130-092-335 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx
Myelin Removal Beads Miltenyi Biotec Order no. 130-094-544 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx
Art 1000 Reach Pipet Tips Molecular BioProducts Order no. 2079 http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61
http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html
Neural Tissue Dissociation Kit (T) Miltenyi Biotec Order no. 130-093-231 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx
Propidium Iodide Solution Miltenyi Biotec Order no. 130-093-233 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx

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References

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Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267, doi:10.3791/1267 (2009).More

Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267, doi:10.3791/1267 (2009).

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