Summary
Этот метод выставляет neuromusculature дрозофилы эмбриональных для иммуногистохимии или электрофизиологические записи. Это полезно для изучения ранних событий в нервно-мышечной развития или при выполнении электрофизиологии в мутантов, которые не могут люк.
Abstract
Дрозофилы является одним из ведущих генетических модель для изучения как эмбриональное развитие и функциональные нейронауки. Традиционно, эти поля достаточно изолированы друг от друга, причем в значительной степени независимых историй и научных сообществ. Тем не менее, взаимодействие между этими обычно разрозненных полей программ развития основных функциональных приобретение электрической сигнализации свойства и дифференциация функциональных синапсов химических во время финальной фазы нейронных формирование контура. Этот интерфейс является критически важной областью для исследований. У дрозофилы, эти фазы функционального развития происходят в течение периода <8 часов (при 25 ° С) в течение последней трети эмбриогенеза. Это поздний период развития, был долгое время считались неразрешимыми для расследования из-за отложения жесткой, непроницаемой эпидермальный кутикулы. Прорыв продвижение было применение воды полимеризации хирургического клея, которые могут быть применены к локально кутикулы чтобы контролируемые рассечение поздней стадии эмбрионов. С спинного продольного разреза, эмбрион может быть в горизонтальном положении, выставляя брюшной нервной и мускулатуры стенки тела в экспериментальном исследовании. Эта система была активно используется, чтобы изолировать и охарактеризовать генетических мутантов, которые препятствуют образованию эмбриональных синапса, и таким образом выявить молекулярные механизмы, регулирующие спецификации и дифференциации синапсов соединений и функциональных свойств синаптической сигнализации.
Protocol
Часть 1: Оборудование и расходные материалы
- Хороший микроскоп вскрытия требуется для вскрытия эмбриона; 40-кратном увеличении предлагается, с 25X глаз части, чтобы максимально увеличить увеличения.
- Изобразительное щипцы (№ 5), необходимые для ручного выбора эмбрионов и devitellinization эмбрионов.
- Оборудование, чтобы сделать и изменить тонкие иглы окошком. Тянули-стекло игл, необходимых для вскрытия. Мы предпочитаем твердого стекла для вскрытия (дольше), но стандартные толстостенных стеклянных трубок (наружный диаметр 1-1,5 мм) тоже работает. Некоторые люди используют тонкие иглы вольфрама, электролизу с желаемой резкости в ванне с использованием 1М NaOH 10 + Amp автотрансформатора батареи. Заостренный иглы вольфрама вскрытии имеют преимущество, что они являются относительно устойчивыми и долговечными. Холлоу иглы стекла (образуются похож на патч зажим электродов) прикреплены к пластиковой трубки и используются во время вскрытия для всасывания и изгнания физиологического раствора, а также контролируемые поставки клея. Различные стеклянные съемники доступны для изготовления стекла иглы. Компьютер запрограммирован съемники могут быть предварительно вытащить разнообразие форм и размеров. Brown-Flaming моделей (Саттер машиностроительный завод) широко благоприятствования. Сложного микроскопа (20-40X цель) должны быть доступны для осмотра и изменить электроды перед использованием.
- Два типа решений обычно используются для ванн эмбриональных тканей при вскрытии: 1) «стандарт» (Ян и Ян, 1976а) или "изменение стандарта" (Broadie, 2000), солончаков, на основе решения, обычно используемые для записи на других беспозвоночных системы , и 2) "гемолимфы-как" (HL) солончаков (Стюарт и др. 1994), компромисс между стандартной солевой раствор и ионной концентрации измеряются в гемолимфы дрозофилы. Следует отметить, что ни один из этих солончаков точно имитировать химического состава гемолимфы в естественных условиях (Broadie, 2000). Стандартный солевой содержит (в мм): 135 NaCl, KCl 5, 4 2 MgCl, 1,8 CaCl 2, 72 сахарозы, 5 ТЭС, рН 7,2. Экспериментаторы также можете рассмотреть коммерчески подготовленные насекомых физиологического раствора (например, Шнайдер насекомых Media), который не подходит для электрофизиологических записи, но, скорее всего, для защиты здоровья облученных тканях.
Часть 2: Постановка эмбрионов и Dissection
- Для оптимального сбор яиц, поддерживать молодых (<7 дней), здоровых мужчин и женщин мухи (20-40) на свежем прокладки горшках в течение 2-3 дней. Укладка горшки обычно состоят из 100 мл пластиковые стаканы (Tri-Pour) перфорированные обеспечить достаточную циркуляцию воздуха, охватывающие 60 мм агар пластины. Агар пластины содержат яблочный или виноградный сок закаленные с агара. Несколько рецептов существует, но один пример выглядит следующим образом: 700 мл воды, 25-30 грамм агара, 300 мл концентрата сока (виноградного или яблочного), 0,5 г метилпарабен (р-hydroxymethylbenzoate) и 30 г сахара. Автоклав воды и агар, и отдельно кипения р-hydroxymethylbenzoate с сахаром и соком. Смешайте сок агар и решения и быстро вылейте на 60 мм пластинами, удаляя пузырьки.
- До сбора яиц, мухи питаются дрожжи пасты (7 граммов дрожжей в 9 мл воды, хранить при температуре 4 ° С) на свежих пластинок, менять не реже двух раз в день в течение по крайней мере два дня. Днем 3, хороший горшок должен производить 100-200 яиц в час. Лучше откладки яиц наблюдается на горшок поддерживаться на боку с агара в пластине поцарапан. Многие эмбрионы будут проложены внутри или рядом с царапинами.
- Для сбора большого количества эмбрионов, мягко передачи эмбрионов из агар пластины в корзину помощью кисти. Корзина может быть сделано с 15 или 50 мл центрифужную пробирку. Отрежьте нижнюю оставляя достаточно площади поверхности для улавливания экрана (70 мкм сетки) между крышкой и верхней части трубки. Промыть эмбрионы с дН 2 0 и положить в чашку Петри свежей 50% до 100% отбеливатель для удаления внешней хориона. Кроме того, яйца можно подбирать индивидуально с использованием тонких щипцов, и dechorionated, размещая их вручную в каплю отбеливателя. Де-chorionation может занять от 30 секунд до 2 минут (свежие отбеливателя намного быстрее), а также должны быть проверены в соответствии рассечение микроскопом. Удаление хориона раскрывает блестящие, прозрачные желточной оболочки. Dechorionated яйца должны быть кратко промыть, либо помещены в физиологическом растворе, как отбеливатель быстро разрушает devitellinized тканей.
- Очень важно тщательно стадии эмбрионы желаемого развития, возраста. Определены дрозофилы эмбриональной стадии (1-17; Кампос-Ортега и Хартенштайн, 1985) не являются полезными, так как все функциональные нервно-мышечной развитие происходит в конце 16 этап или этап 17. Таким образом, эмбрионы в постановке развития часов при 25 ° С в увлажненной инкубатор, в часы после оплодотворения, или, чаще, после откладки яиц (AEL). В этих условиях эмбриогенеза длится 21 + / - 1 час при 25 ° C.
- Яйца из приурочен яйца лежали (1-2 чы), которые надлежащим возрасте находятся рядом рассматриваться для морфологических критериев. После продолжительного мытья в дН 2 O, dechorionated яйца помещаются в пластиковый блюдо культуры (под дН 2 O) для просмотра. Правильная постановка может быть подтверждено с морфологическим критериям использования отраженного света с рассечение микроскоп (Кампос-Ортега и Хартенштайн, 1985). Зрелые поздней стадии эмбрионов (22-24h AEL) на грани штриховки, как правило, признаются сегментации кутикулу и завышенные трахеи. Эмбрионы могут быть генотипировали использованием GFP балансиры и флуоресцентного микроскопа рассечение с соответствующими фильтрами.
- Для вскрытия, dechorionated и умственно поставил эмбрионов прилагаются (спинной стороной вверх) на покровное по капле физиологического раствора (см. шаг 1.5). Эмбрионы будут удалены из желточной оболочки путем прокола мембраны возле переднего или заднего конца с микропипетки стекла или вольфрамовой иглой, а затем осторожно освобождая эмбриона от мембраны. В ходе подготовки к диссекции, эмбрион должен быть расположен на покровное с спинной до поверхности (спинной стороны до вскрытия выставят вентральной нервной системы и neuromusculature для экспериментов. Однако эмбрион очевидно, может быть расположен и в других отношениях для облегчения доступа к другим ткани.)
- Ранние стадии эмбрионов (<16 часов AEL) крепятся непосредственно для очистки стекла или стекла с покрытием полилизином (поли-L-лизин гидробромид; Broadie и БАТЭ, 1993а, б). Старые эмбрионов (> 16 часов AEL), после кутикулы образования, должны быть приклеены, в идеале, чтобы Sylgard покрытием (Dow Corning) покровные. Воды полимеризации цианоакрилат хирургических или ветеринарных клей используется (Broadie и БАТЭ, 1993c, г). Клей поставляется через небольшой пипеткой стеклянный электрод (10-20 мкм внутренний диаметр кончика), подключенных к резиновой трубкой с клеем поток контролируется рот давления. Необходимо соблюдать осторожность во время клей доставки, а клей полимеризуется быстро после контакта с раствором. Отметим также, что склеивание не может быть выполнена в физиологическом растворе с отсутствием или низкой концентрации ионов двухвалентного, так как клей требует двухвалентных ионов к полимеризации. Небольшое количество клея первом использовании твердо приложить голову и хвост.
- Как только концы эмбриона приклеены к покровным, надрез вдоль спинной средней линии с электродом стекла или заостренным вольфрамовой иглы. Это стало легче, осторожно перфорационные линии разреза до принятия окончательного монтажа. Стороны разреза затем прикрепляется к покровным с более клей, чтобы мягко распространению эмбриона квартиры. Внутренние органы, включая кишечник, жир тела и, опционально, трахеи затем удаляются путем всасывания с помощью стеклянной пипетки прилагается к резиновой трубки (Broadie и Бейт 1993а-в). Эмбрион должен теперь быть прикреплены к плоской покровное, эпидермис вниз с вентральной центральной нервной системы, периферических нервов, и соматической мускулатуры подвергается для экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Точная постановка эмбрионов является критическим из-за быстрого созревания функциональных свойств с течением времени хода всего несколько часов. Несколько вопросов, усложняют эту постановку. Во-первых, большинство исследователей использовать приурочен яйца откладывает на стадии эмбриона, но откладки яиц время может варьироваться в самых широких от животного к животному в разных условиях (Broadie и соавт. 1992). В частности, женщины на ограниченной диете, как правило, сохраняют оплодотворенные яйца в течение длительного времени перед укладкой. Поэтому крайне важно, чтобы "очистить" женщины, питаясь богатыми диеты дрожжей, по крайней мере за 2 дня до сбора яиц (Broadie и соавт. 1992). Кроме того, пожилые женщины также сохранить яйца на более длительный период перед укладкой. Старше женщина может регулярно откладывают яйца только пару часов до их вылупления. Поэтому важно использовать молодых женщин (<7 дней) для наиболее последовательного укладки раз (Broadie и соавт. 1992). Во-вторых, во время последней стадии эмбриона, трудно стадии эмбрионов исключительно за счет морфологических критериев. Большинство явные черты постановки, являются полными, <16 часов AEL (Кампос-Ортега и Хартенштайн, 1985), но большинство функциональное развитие происходит> 16 часов AEL. Поздно особенностей развития (например, трахеи воздух заполнения, дубильные кутикулы) очень мало, и, как правило, меньше временно запрещен. По этим причинам мы рекомендуем комбинаторный подход: собрать яйца от 1-2 ч приурочен лежит, этапе четко определенных ранних морфологических событий <30 минут по времени (например, гаструляции, спинной закрытия, 3-часть кишки; Кампос-Ортега и Хартенштайн, 1985), а затем инкубировать до желаемого возраста в хорошо контролируемых 25 ° C инкубатора.
Руководство вскрытие и нанесения клея требуют мелкой моторики под микроскопом, что мало кто изначально обладают. Эти навыки должны быть разработаны в течение долгого времени. Экспериментаторы должны быть готовы к совершению минимум несколько недель ежедневного посвященный практике, прежде чем ожидали высокую частоту успеха. Подготовка пригодных для микроскопического исследования центральной нервной системы и некоторые вентральной нервно-мышечных контактов должны быть достижимыми относительно быстро, в то время как здоровые подготовка подходит для электрофизиологии, как правило, требуют больше усилий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
КБ поддерживается NIH грант GM54544.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 (for 60 mm dish; other sizes available) | Cages can also be home made using punctured tri-pour beakers, as shown in video |
Sylgard 184 | Dow Corning | Available from various companies | Surgical glue adheres better to sylgard-coated coverslips |
Fine glass tubing, outer diameter 1.0-1.5 mm | Various | For pulling into fine glass needles for dissection and tubes for glue delivery | |
Plastic tubing, to attach to glass pipette for mouth suction and glue application | Tygon | Tubing inner diameter needs to match glass outer diameter. |
References
- Aravamudan, B., Fergestad, T., Davis, W. S., Rodesch, C. K., Broadie, K. Drosophila UNC-13 is essential for synaptic transmission. Nat. Neurosci. 2, 965-971 (1999).
- Auld, V. J., Fetter, R. D., Broadie, K., Goodman, C. S. Gliotactin a novel transmembrane protein on peripheral glia, is required to form the blood-nerve barrier in Drosophila. Cell. 81, 757-767 (1995).
- Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
- Baines, R. A., Robinson, S. G., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Postsynaptic expression of tetanus toxin light chain blocks synaptogenesis in Drosophila. Curr. Biol. 9, 1267-1270 (1999).
- Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).
- Bate, M. The embryonic development of the larval muscles in Drosophila. Development. 110, 791-804 (1990).
- Bate, M., Martinez Arias, A. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Vol. I, II (1993).
- Baumgartner, S., JT, L. ittleton, Broadie, K., MA, B. hat, Harbecke, R., JA, L. engyel, Chiquet-Ehrismann, R., Prokop, A., Bellen, H. J. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87, 1059-1068 (1996).
- AH, B. rand Perrimon N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
- Broadie, K. Electrophysiological Approaches to the Neuromusculature. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 273-296 (2000).
- Broadie, K., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 144-166 (1993a).
- Broadie, K., Bate, M. Development of larval muscle properties in the embryonic myotubes of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 167-180 (1993b).
- Broadie, K., Bate, M. Activity-dependent development of the neuromuscular synapse during Drosophila embryogenesis. Neuron. 11, 607-619 (1993c).
- Broadie, K., Bate, M. Synaptogenesis in the Drosophila embryo: innervation directs receptor synthesis and localization. Nature. 361, 350-353 (1993d).
- Broadie, K., Bellen, H. J., DiAntonio, A., Littleton, J. T., Schwarz, T. L. The absence of Synaptotagmin disrupts excitation-secretion coupling during synaptic transmission. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10727-10731 (1994).
- Broadie, K., Prokop, A., Bellen, H. J., O'Kane, C. J., Schulze, K. L., Sweeney, S. T. Syntaxin and Synaptobrevin function downstream of vesicle docking in Drosophila. Neuron. 15, 663-673 (1995).
- Broadie, K., Rushton, E., Skoulakis, E. C. M., Davis, R. L. eonardo a 14-3-3 protein involved in learning, regulates presynaptic function. Neuron. 19, 391-402 (1997).
- Broadie, K., Skaer, H., Bate, M. Whole-embryo culture of Drosophila: development of embryonic tissues in vitro. Roux's Arch. Develop. Biol. 201, 364-375 (1992).
- Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer. Berlin. (1985).
- Deitcher, D. L., Ueda, A., Stewart, B. A., Burgess, R. W., Kidokoro, Y., Schwartz, T. L. Distinct requirements for evoked and spontaneous release of neurotransmitter are revealed by mutations in the Drosophila gene neuronal-synaptobrevin. J. Neurosci. 18, 2028-2039 (1998).
- Featherstone, D. E., Broadie, K. Surprises from Drosophila: genetic mechanisms of synaptic development and plasticity. Brain Res. Bull. 53, 501-511 (2000).
- Featherstone, D. E., Rushton, E. M., Hilderbrand-Chae, M., Phillips, A. M., Jackson, F. R., Broadie, K. Presynaptic glutamic acid decarboxylase is required for induction of the postsynaptic receptor field at a glutamatergic synapse. Neuron. 27, 71-84 (2000).
- Featherstone, D. E., Davis, W. S., Dubreuil, R. R., Broadie, K. Drosophila alpha- and beta-spectrin mutations disrupt presynaptic neurotransmitter release. J Neurosci. 21, 4215-4224 (2001).
- Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nat Neurosci. 5, 141-146 (2002).
- Featherstone, D. E., Rushton, E., Rohrbough, J., Liebl, F., Karr, J., Sheng, Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. An essential Drosophila glutamate receptor subunit that functions in both central neuropil and neuromuscular junction. J. Neurosci. 25, 3199-3208 (2005).
- Fergestad, T., Davis, W. S., Broadie, K. The stoned proteins regulate synaptic vesicle recycling in the presynaptic terminal. J Neurosci. 19, 5847-5860 (1999).
- Fergestad, T., Wu, M. N., Schulze, K. L., Lloyd, T. E., Bellen, H. J., Broadie, K. Targeted mutations in the syntaxin H3 domain specifically disrupt SNARE complex function in synaptic transmission. J Neurosci. 21, 9142-9150 (2001).
- Fergestad, T., Broadie, K. Interaction of stoned and synaptotagmin in synaptic vesicle endocytosis. J Neurosci. 21, 1218-1227 (2001).
- Goodman, C. S., Doe, C. Q. Embryonic Development of the Drosophila Central Nervous System. In The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 1131-1206 (1993).
- Harrison, S. D., Broadie, K., Goor, J. vande, Rubin, G. M. Mutations in the Drosophila Rop gene suggest a function in general secretion and synaptic transmission. Neuron. 13, 555-566 (1994).
- Huang, F. D., Woodruff, E., Mohrmann, R., Broadie, K. Rolling blackout is required for synaptic vesicle exocytosis. J. Neurosci. 26, 2369-2379 (2006).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. J. Physiol. 262, 215-236 (1976b).
- Kidokoro, Y., Nishikawa, K. I. Miniature endplate currents at the newly formed neuromuscular junction in Drosophila embryos and larvae. Neuroscience Research. 19, 143-154 (1994).
- Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. J. Neurosci. 17, 9642-9655 (1997).
- Mohrmann, R., Matthies, H. J., Woodruff III, E., Broadie, K. Stoned B mediates sorting of integral synaptic vesicle proteins. Neuroscience. 153, 1048-1063 (2008).
- Nishikawa, K. I., Kidokoro, Y. Junctional and extrajunctional glutamate receptor channels in Drosophila embryos and larvae. J. Neurosci. 15, 7905-7915 (1995).
- Renden, R., Berwin, B., Davis, W., Ann, K., Chin, C. T., Kreber, R., Ganetzky, B., Martin, T. F., Broadie, K. Drosophila CAPS is an essential gene that regulates dense-core vesicle release and synaptic vesicle fusion. Neuron. 31, 421-437 (2001).
- Rohrbough, J., Broadie, K. Electrophysiological Analysis of Synaptic Transmission in Central Neurons of Drosophila Larvae. J. Neurophysiol. 88, 847-860 (2002).
- Rohrbough, J., Rushton, E., Palanker, L., Woodruff, E., Matthies, H. J., Acharya, U., Acharya, J. K., Broadie, K. Ceramidase regulates synaptic vesicle exocytosis and trafficking. J. Neurosci. 24, 7789-7803 (2004).
- Rohrbough, J., Rushton, E., Woodruff, E. 3rd, Fergestad, T., Vigneswaran, K., Broadie, K. Presynaptic establishment of the synaptic cleft extracellular matrix is required for postsynaptic differentiation. Genes Dev. 21, 2607-2628 (2007).
- Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J. Comp. Physiol.. A175, 179-191 (1994).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
- Tsunoda, S., Salkoff, L. Genetic analysis of Drosophila neurons: Shal, Shaw, and Shab encode most embryonic potassium currents. J. Neurosci. 15, 1741-1754 (1995).
- Ueda, A., Kidokoro, Y. Longitudinal body wall muscles are electrically coupled across the segmental boundary in the third instar larva of Drosophila melanogaster. Invertebrate Neuroscience. 1, 315-322 (1996).
- Wu, C. F., Haugland, F. N. Voltage clamp analysis of membrane currents in larval muscle fibers of Drosophila. J. Neurosci. 5, 2626-2640 (1985).
- Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. J Neurosci Methods. 162, 198-205 (2007).
- Yoshikami, D., Okun, L. Staining of living presynaptic nerve terminals with selective fluorescent dyes. Nature. 310, 53-56 (1984).
- Zagotta, W. N., Brainard, M. S., Aldrich, R. W. Single-channel analysis of four distinct classes of potassium channels in Drosophila muscle. J. Neurosci. 8, 4765-4779 (1988).
- Zhang, Y. Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. A living synaptic vesicle marker: synaptotagmin-GFP. Genesis. 34, 142-145 (2002).