Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

Summary

En kort protokoll för protein färgning med Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 i polyakrylamidgeler beskrivs utan att använda organiska lösningsmedel eller ättiksyra som i den klassiska färgning förfaranden med CBB.

Abstract

I klassisk protokoll protein färgning med Coomassie Brilliant Blue (CBB), lösningar med höga halter av giftiga och brandfarliga organiska lösningsmedel (metanol, etanol eller 2-propanol) och ättiksyra används för fixering, färgning och avfärgning av proteiner i en gel efter SDS -PAGE. För att påskynda förfarandet, värme färglösningen i mikrovågsugn en kort tid används ofta. Detta resulterar vanligen i avdunstning av giftiga eller farliga metanol, etanol eller 2-propanol och en stark lukt av ättiksyra i labbet som bör undvikas av säkerhetsskäl. I ett protokoll publicerades ursprungligen i två patentansökningar av EM Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), är ett alternativ sammansättning färglösningen beskrivs där inga organiska lösningsmedel eller syra används. Den CBB löses upp i bidistilled vatten (60-80mg av CBB G-250 per liter) och 35 mM HCl läggs till som den enda förening i färglösningen. Den CBB staning av gelen görs efter SDS-PAGE och grundlig tvättning av gel i bidistilled vatten. Genom uppvärmning av gelen under tvätt och färgning steg kan processen vara klar snabbare och inga giftiga eller farliga föreningar som avdunstar. Den färgning av proteinerna sker redan inom 1 minut efter uppvärmning gelen i färglösningen och är fullt utvecklad efter 15-30 minuter med en lätt blå bakgrund som destained helt av långvarig tvätt av färgade gel i bidistilled vatten, utan att påverka färgade proteinet band.

Protocol

Del 1: Beredning av CBB färglösning 60-80 mg CBB G-250 löses upp i 1 liter bidistilled vatten under omrörning i 2-4 timmar. Slutligen är 3 ml koncentrerad HCl tillsätts den mörkblå lösning med omrörning i ytterligare en minut och förvaras mörkt för senare användning. Lösningen kan lagras i veckor upp till flera månader utan att förlora sin färgning effektivitet. Koncentrerad HCl bör hanteras med den vanliga vården und används under ett dragskåp. Den slutliga lösningen kommer a…

Discussion

• Tvätten steg är avgörande för en effektiv färgning av proteinerna. En minskad tvättid under 2 minuter eller minskad mängd vatten (<50 ml) kan resultera i ljusblått protein band, sannolikt på grund av större mängder kvarvarande SDS i gelen.
• Om de proteiner kommer att analyseras med masspektrometri, ska värmen steg i mikrovågsugn ska hoppas över, är det dags för tvätt av gelen förlängas till ca 10 min i varje steg och färgningen tiden förlängs till bandet intensiteten tillräckligt stark . Värme gelen …

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Coomassie Brilliant Blue G-250		AppliChem	A3480	any other CBB G-250 could be used as well
Concentrated HCl