Summary
In deze video presenteren we de
Abstract
CD40-geactiveerde B-cellen (CD40-B-cellen) zijn geïdentificeerd als een alternatieve bron van immuno-stimulerende antigen-presenterende cellen (APC) voor de immunotherapie van kanker 1-3. In vergelijking met Dendritische cellen (DC's), de beste gekarakteriseerd APC, CD40-B cellen hebben een aantal verschillende biologische en technische eigenschappen. Net als bij DC's, B-cellen een verhoogde expressie van MHC en co-stimulerende moleculen (Fig.1b) show, vertonen een sterke migratie capaciteit en presenteren antigeen presentatie efficiënt T-cellen, na stimulatie met interleukine-4 en CD40 ligand (CD40L). Echter, in tegenstelling tot onrijpe of rijpe DCs, CD40-B-cellen drukken de volledige lymfeklier homing triade bestaande uit CD62L, CCR7/CXCR4 en leukocyten functie antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), die nodig zijn voor de homing naar secundair lymfoïde organen (Fig.1a) 3. CD40-B-cellen kan worden gegenereerd zonder de moeilijkheden van zeer kleine hoeveelheden van perifeer bloed, dat verder kan worden uitgebreid naar in vitro zeer grote hoeveelheden van zeer zuivere CD40-B-cellen (> 10 9 cellen per patiënt) van gezonde donoren en kanker patiënten (Fig.1c, d) 1,4.
In dit protocol hebben we laten zien hoe je volledig geactiveerd CD40-B-cellen van menselijke PBMC te verkrijgen. De belangrijkste moleculen voor de cel cultuur CD40-ligand, interleukine-4 (IL-4) en ciclosporine A (CsA), die aangevuld in een 3-4 dagen cultuur cyclus. Voor laboratorium doeleinden CD40-stimulatie wordt verzorgd door NIH/3T3 cellen die recombinant humaan CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. Om te voorkomen dat besmetting met niet-getransfecteerde cellen, expressie van de menselijke CD40-ligand op de transfectanten moet regelmatig gecontroleerd worden (fig. 2).
Na 14 dagen CD40-B-cel culturen bestaan uit meer dan 95% zuiver B-cellen en een uitbreiding van CD40-B-cellen over 65 dagen is het vaak mogelijk zonder enig verlies van functie 1, 4. CD40-B-cellen efficiënt te nemen, verwerken en presenteren antigenen aan T-cellen 6. Zij niet alleen premier naϊve, maar ook uit te breiden geheugen T-cellen 7,8. CD40-geactiveerde B-cellen kunnen worden gebruikt voor het B-cel activatie, differentiatie en functie te bestuderen. Bovendien, zij vertegenwoordigen een veelbelovend instrument voor therapeutische of preventieve vaccinatie tegen tumoren 9.
Protocol
Het protocol voor de generatie van de menselijke CD40-geactiveerde B-cellen uit PBMC is verdeeld in twee delen: deel A toont de bereiding van de CD40-ligand uitdrukken NIH/3T3 cellen, die gebruikt zal worden als plate-gebonden feeder cellen. Deel B beschrijft de actuele CD40-B cultuur.
A. Bereiding van feeder-cellen (tCD40L NIH/3T3)
De tCD40L NIH/3T3 is een aanhanger muis fibroblast cellijn, die nooit zou moeten worden volledig confluent. De cellen zijn dan ook twee keer gesplitst per week. Het kweken van meer dan 6 weken wordt niet aanbevolen.
- Verwijder oude medium van de primaire cultuur met een steriele pipet en was cellen met 10 ml 1x PBS. Zuig het PBS na het wassen.
- Voeg 4 ml trypsine / EDTA in een 75 cm 2 fles gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C. Gebruik zachte tikken om de cellen los te maken.
- Voeg 10 ml van de wild-type medium en draai voorzichtig.
- Breng de celsuspensie in een 50 ml buis met een steriele pipet en de spin de cellen neer op 225 xg gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ml van wild type medium. Tel het aantal cellen van een aliquot van de celsuspensie en voor te bereiden drie 50 ml buizen met het juiste aantal cellen:
- 1,5 x 10 6 cellen voor subcultuur
- 0,2 x 10 6 cellen / goed voor bestraling gebruikt worden voor de CD40-B-cel cultuur
- rest te bevriezen (indien nodig).
- Spin de cellen neer op 225 xg gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant.
- Voor subcultuur: resuspendeer 1,5 x 10 6 cellen in 10 ml wild type medium in een 75 cm 2 celkweek kolf (celdichtheid 1,5 x 10 5 cellen / ml), voeg G-418 [0,7 mg / ml] en incubeer de cellen op 37 ° C met 5% CO 2. Splits de cellen twee keer per week.
- Voor de CD40-B-cel cultuur: U moet 1,2 x 10 6 cellen voor een 6-wells plaat. Resuspendeer de cellen in wild-type medium bij een dichtheid van 0,1 x 10 6 cellen / ml en bestralen ze op 78 Gy. Plaat 2 mL van de celsuspensie in elk putje en incubeer ze op 37 ° C met 5% CO 2. Gebruik deze voorbereid platen voor B-cel stimulatie bij tCD40L NIH/3T3 cellen aanhanger (ten minste 4 uur: controleer hechting met de microscoop, wacht niet meer dan 24 uur tot B-cel stimulatie te starten). (Ga verder met B.)
B. CD 40-B-cel cultuur
I. Voorbereiding van PBMC's voor de CD40-stimulatie (dag 0):
Let op: voordat u verder gaat vergewissen dat feeder cellen aanhanger zijn. Voeg altijd nieuwe oplossingen van interleukine-4 en ciclosporine A aan het groeimedium onmiddellijk voor gebruik.
- Neem PBMC's, hetzij vers of de juiste ontdooid. Resuspendeer PBMC tweemaal in 50 ml 1x PBS om ze te wassen en naar beneden draaien eerste keer op 265 xg gedurende 7 minuten en een tweede keer op 190 xg gedurende 7 minuten naar andere cellen te verwijderen. Gooi supernatant en resuspendeer de cellen in 20 ml PBS. Bepaal het aantal cellen in een hoeveelheid van de celsuspensie.
- Spin down benodigde hoeveelheid cellen op 225 xg gedurende 5 minuten. Voor een 6-wells plaat 4 x 10 6 cellen / putje nodig zijn, dus 24 x 10 6 cellen per plaat.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de PBMC op 1 x 10 6 cellen / ml in het CD40-B kweekmedium vers aangevuld met 50 U / mL van interleukine-4 als een groeifactor en 0,63 ug / ml cyclosporine A tot uitgroei van T-cellen te voorkomen (Gezien concentraties verwijzen naar een ml kweekmedium!).
- Verwijder het supernatant van de 6-well plaat pre-geïncubeerd met tCD40L NIH/3T3 cellen.
- Was de hechtende tCD40L NIH/3T3 cellen met 2 ml PBS per well eerste en in een tweede stap met 2 ml van CD40-B wassen medium.
- Voorzichtig Voeg 4 ml van PBMC suspensie (1 x 10 6 cellen / ml) aan elk putje van de 6-wells plaat.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO 2.
- Op dag 7, reculture de cellen (Ga verder met 3.2.).
II. Hercultivering van CD40-B-cellen (dag 7 en vervolgens om de 3-4 dagen):
- Oogst clusters van CD40-B-cellen van de 6-well plaat door mengen met een 10 ml pipet en het zwembad ze in een 50 ml buis.
- Spin neer op 225 xg gedurende 7 minuten en volledig de supernatant te vervangen door CD40-B wassen medium. Terwijl het tellen van de cel hoeveelheid van een hoeveelheid, draai de cellen neer op 225 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer CD40-B-cellen in CD40-B kweekmedium bij een concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml.
- Voeg nieuwe oplossingen van interleukine-4 in een concentratie van 50 U / ml en 0,63 ug / ml cyclosporine A aan het medium.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof uit een 6-wells plaat pre-geïncubeerd met tCD40L NIH/3T3 cellen.
- Was de hechtende cellen met 2 ml PBS per well eerste en in een tweede stap met 2 ml van CD40-B wassen medium.
- Incubeer de platen bij 37 ° C met 5% CO 2.
- Subcultuur cellen weer om de 3-4 dagen om te eindigen met een zeer zuivere menselijke CD40-geactiveerde B-cellen na een totaal van 14 dagen.
C. Trouble-shooting - Wat gebeurt er als CD40-B-cellen niet groeien?
- Heb je gecontroleerd of CD40 ligand expressie van feeder-cellen?
- De plaat-gebonden feeder cellen die worden gebruikt voor het stimuleren mag niet ouder zijn dan 24 uur?
- Is een besmetting met mycoplasma mogelijk?
- Was de interleukine-4-oplossing voor de suppletie vers ontdooid en had het passende biologische activiteit?
- Was cyclosporine A toegevoegd in de juiste concentratie?
Figuur 1. Alstublieft Klik hier voor een grotere versie van figuur 1.
Figuur 2. Alstublieft Klik hier voor een grotere versie van figuur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Preparation of Media: | |||
| 1. Feeder cell wild type medium | |||
| DMEM-Ham’s / F12 | |||
| L-Glutamine (365 μg/mL) | |||
| FBS (10%) | |||
| HEPES (10 mM) | |||
| Gentamycin (15 μg/mL) | |||
| 2. Feeder cell selection medium | |||
| DMEM-Ham’s / F12 | |||
| L-Glutamine (365 μg/mL) | |||
| FBS (10%) | |||
| HEPES (10 mM) | |||
| Gentamycin (15 μg/mL) | |||
| G-418 (0.7 mg/mL) | |||
| 3. CD40-B washing medium | |||
| IMDM | |||
| L-Glutamine (584 μg/mL) | |||
| HEPES (25 mM) | |||
| Gentamycin (15 μg/mL) | |||
| 4. CD40-B culture medium | |||
| IMDM | |||
| L-Glutamine (584 μg/mL) | |||
| HEPES (25 mM) | |||
| Gentamycin (15 μg/mL) | |||
| rh Transferrin (50 μg/mL) | |||
| rh Insulin (5 μg/mL) | |||
| AB-Humanserum (10%) | |||
| B. Miscellaneous Reagents: | |||
| DMEM / Ham’s F12 | PAA Laboratories | Cat No: E15-813 | |
| IMDM | Invitrogen | REF 21980-032 | |
| Dulbecco’s PBS (10x) | PAA Laboratories | Cat No H15-011 | |
| AB-Human Serum | Invitrogen | Cat No 34005100 | |
| holo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | Cat No T0665 | |
| Insulin human | Sigma-Aldrich | Cat No I2643 | |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 | |
| Recombinant Human Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 11130045 | |
| Cyclosporin A | Novartis AG | Cat No NDC 0078-0109-01 | |
| FBS | Lonza Inc. | Cat No DE14-802C | |
| HEPES Buffer | PAA Laboratories | Cat No S11-001 | |
| G-418 Sulphate | PAA Laboratories | Cat No P02-012 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen | REF 15400-054 | |
| C. Miscellaneous Supplies: | |||
| Sterile pipette tips | Sarstedt Ltd | ||
| 6-well plate | Nalge Nunc international | Cat No 140675 | |
| 50mL conical tube | BD Biosciences | Cat No 352070 | |
| Tissue culture flask | Sarstedt Ltd | Cat No 83.1813.002 | |
References
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).
- Bergwelt-Baildon, M. von CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107, 2786-2789 (2006).
- Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).
- Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma. Blood. 85, 1903-1912 (1995).
- Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).
- von Bergwelt-Baildon, M. S. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99, 3319-3325 (2002).
- Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).
- Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15, 955-965 (2008).
