瓜沙手続におけるヘムオキシゲナーゼ-1アップレギュレーションの生物発光イメージング

Summary

瓜沙、中国の伝統的な治療皮膚を削ることは、皮下微小血管の血液の溢出を引き起こします。我々は、HO - 1 -の生物発光イメージングのプロトコルを報告する

Abstract

瓜沙は、皮下微小血管の血液の溢出やあざの原因となる皮膚を削ることを採用し、伝統的な中国の民間療法です。 HO - 1 -の生物発光の光イメージングのためのプロトコル

Protocol

1. 女性のHO - 1 - ルシフェラーゼトランスジェニックマウス（4-6週齢）は到着後、（株）タコ農場から購入することができる、マウスが宿泊を許可するには、最低4日間、動物の収容施設に配置されます。
2. 生物発光イメージングのための準備：
   1. 各HO - 1マウスを量る。動物の体重は、ルシフェリンの投与量を計算するために必要です。
   2. 脱毛：またはバック動物の腹部および/ ​​上の毛リムーバーNairさん®を適用するために綿のスワップを使用してください。 5〜10秒待って。髪をふき取るためにきれいな綿のスワップを使用してください。クリーン残りの髪を拭くために蒸留水に組織片をつけます。
   3. バックグラウンドノイズを低減するためIVIS 100ステーションのイメージングプラットフォーム上で非蛍光黒い紙（ストラスモアArtagain ®黒い紙）を置きます。
   4. ルシフェリン（Xenogen社から）7.5 mg / mlの（滅菌H ₂ Oに溶解）の濃度で溶液を調製します。ルシフェリンの投与量は65.5 mg / kg体重である。このように、20グラムのマウスには、0.175ミリリットルルシフェリン溶液の腹腔内注射を必要とします。これを達成するために、ルシフェリン溶液（0.175ミリリットル）の単一の注入量は、26ゲージの針で注射器にプリロードされ
3. 瓜沙手順：瓜沙は、生物発光イメージングプロトコルを実行する前に一度だけ適用されます。瓜沙が苦痛ではないので、マウスだけ冷静にイソフルランによる短時間麻酔にする必要があります。瓜沙の手順は、次の手順が含まれます：
   1. 瓜沙で瓜沙の手順の間に数回をターゲットと肌の部分を潤滑するために食用油または蒸留水を適用します。
   2. 繰り返しセラミックスープ用のスプーンやプラスチックのスプーンを使用して、外柔内剛の力でマウスの背中の毛のない領域を削る。
   3. バックスキンは、通常2〜3分以内に達成皮下溢血の記号、である、赤になるまで、スクレイピングは続きます。
4. HO - 1の発現上昇が数時間にわたって徐々に構築されるように生物発光イメージングは、瓜沙直後または数時間起動されることがあります。生物発光イメージングのための手順は、次のとおりです。
   1. イソフルラン（1.5％）、医療グレードの空気の混合物で満たされた麻酔導入チャンバー内にマウスを麻酔。
   2. マウスに麻酔をしたら、IVIS 100光学イメージングステーション上のイメージング室へマウスを移動してください。仰臥位（上腹部）にマウスを置きます。イメージングチャンバーは、継続的にイソフルランの1.5％を注入される。イメージングプラットフォームは、° C、マウスを暖かく保つために37℃で加熱される。
   3. "ミディアムビニング"で画像の取得と30秒に設定された露光時間を設定します。画像を取得するために開始します。手動または自動で、画像の取得を3分ごとに繰り返すようにマシンを設定します。最初のイメージの取得後は、利息（ROI）の領域は、腹部、胸部、および頭部の領域をカバーするように描画されます。このROIは、コピーされ、"リビングイメージ®"、IVIS 100駅に付随するソフトウェアを使用して次の画像に貼り付けられます。
   4. 信号強度は毎秒の光子で測定されます。そのピーク値に達すると、ピーク時間後に約5〜10分間の画像上でマウスを保つために信号強度の時間をマーク。
   5. 仰臥位でのイメージング買収が完了すると、マウスを裏返しにし、腹臥位（バックアップ）でそれを置く。今ソフトウェア"リビングイメージ®"の利用で、背中や頭部の領域をカバーするために描かれたROIと5〜10分のためのイメージング動物を続ける。画像の選択は、仰臥位後に腹臥位は任意です。一つは、興味のある主要な器官に応じて、腹臥位で開始するかを選択できます。別のオプションは、画像に別々の実験では仰臥位となりやすい位置です。
   6. 腹臥位でのイメージング買収が完了したとき、イソフルランをオフにし、回復するために誘導室にイメージング室からマウスを移動します。誘導室は、現在唯一の医療の空気を注入し、マウスは、通常1分未満で目覚めています。
   7. 後処理のための画像データを保存します。
   8. 初期イメージング研究の後、追加の画像の取得は、瓜沙後数日間実施される。一つのサンプルスケジュールは、12時間^目 、24 ^番目の時間、36時間^目 、48 ^番目の時間、72 ^回目の時間と120時間^目でのイメージングを繰り返したが、撮影スケジュールの正確なタイミングは柔軟です。長期のフォローアップが必要な場合は、追加のイメージングセッションが追加される可能性があります。髪が戻って成長している場合はイメージを作成する前に、毛の取り外しの手順を繰り返します。
5. 対照群の場合は、すべての手順を繰り返しますが瓜沙（ステップ3）をスキップします。マウスの同じグループはコントロールと瓜沙、制御の経験の両方に使用されている場合erimentは、好ましくは瓜SHA手順の前または少なくとも一ヶ月後に行われるべきである。

代表的な結果：

瓜沙への応答におけるHO - 1の生体内で上方制御における図1のshowの生物発光画像。図2のグラフは、瓜沙に関連し、同じマウスの全身から光束（光子/秒）で120時間以上の定量的な経時変化を示しています...

図1の左からそれぞれ18時間、36時間および120時間後瓜沙で瓜沙の前に、同じマウスの正面図（仰臥位）の右側に、代表的な画像、、へ。瓜沙後、1つは消化管、生殖管、肝臓、腎臓（バックビューから、図示せず）、及び他の領域を包含する多臓器の重要な信号強度の増加の進行状況を観察する。してくださいここをクリックして図1の拡大版のために。

図2図1の同じマウスで瓜沙の後120時間にわたって追跡全身からフラックスの定量的変化（光子/秒）。してくださいここをクリックして図2の拡大バージョンを参照すること。

Discussion

HO - 1、ヘムオキシゲナーゼの誘導型、の転写は、ヘム、過酸化水素、紫外線照射、低酸素症、および物理的ストレスを含む多くの要因によってアップレギュレートされる。そのような報告されたHO - 1の生物発光のプロトコルとして全身イメージングでは、複数の臓器で、全身HO - 1発現のクイックスナップショットを提供します。小動物では、生物発光イメージングは​​、高感度のin vivo全身遺伝子発現の変化をリアルタイムで定量的な縦光学的評価、図のようにできます。生物発光分子イメージングは​​、コストを低減し、実用的な急速に複雑なシステム生物学の仮説の検討に必要な統計的検出力を達成するために、提案された医薬品や他の治療的介入の全身への影響のために評価すること、小動物における遺伝子発現アッセイのスループットが向上します。ひとつの制限は、解剖学の低空間分解能である。断層機能を持つ新しい光学イメージングシステムは、問題を軽減するでしょう。マイクロCTや小動物MRIによる画像の取得と登録が正常解剖を識別するために役立つだろう。その他の制限は、低光の組織を通じて浸透し、トランスジェニック動物の必要性です。これらは本質的に大規模な動物やヒトへの使用への変換を妨げるものが、小動物系の生物学や臨床治療の仮説検証のための重要な欠点ではありません。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Luciferin	Caliper Life Sciences	P/N 122796	Previously Xenogen
IVIS 100	Caliper Life Sciences		Previously Xenogen