Summary
Wij stellen voor een genormaliseerd Geboren aanpak voor optische projectie Tomografie (BnOPT) die goed is voor de absorptie-eigenschappen van beeld gebracht monsters te verkrijgen accurate en kwantitatieve fluorescentie tomografische reconstructies. We maken gebruik van de voorgestelde algoritme om de fluorescentie moleculaire sonde distributie binnen kleine dierlijke organen te reconstrueren.
Abstract
Optische projectie tomografie is een drie-dimensionale beeldvormende techniek die is onlangs geïntroduceerd als een imaging tool in de eerste plaats in de ontwikkelingsbiologie en gen-expressie studies. De techniek maakt biologische monster optisch transparant door eerst drogen en ze vervolgens te plaatsen in een mengsel van benzylalcohol en benzylbenzoaat in een 2:1 verhouding (Babb of Murray s Heldere oplossing). De techniek maakt biologische monsters optisch transparant door eerst drogen ze in ethanolreeks oplossingen dan ze te plaatsen in een mengsel van benzylalcohol en benzylbenzoaat in een 2:1 verhouding (Babb of Heldere oplossing Murray s) te wissen. Na het clearing proces van de verstrooiing bijdrage in het monster kan sterk worden verminderd en maakte bijna te verwaarlozen, terwijl de absorptie bijdrage kan niet volledig worden geëlimineerd. Als u probeert om de fluorescentie verdeling binnen de steekproef te reconstrueren in onderzoek, deze bijdrage van invloed op de reconstructies en leidt, onvermijdelijk, om beeld artefacten en kwantificering fouten .. Terwijl de opname kan verder worden verminderd met een permanentie van weken of maanden in de open plek media, zal dit leiden tot een progressief verlies van fluorescentie en tot een onrealistisch lange monster verwerking tijd. Dit is het geval wanneer het reconstrueren zowel exogene contrastmiddelen (moleculaire contrastmiddelen) als endogene contrast (bijvoorbeeld reconstructies van genetisch uitgedrukt fluorescerende eiwitten).
Protocol
Imaging Procedure
De experimentele opstelling wordt in detail weergegeven in figuur 1. Een lichtbron LS dient zowel als verlichting voor absorptie metingen en als excitatie bron voor fluorescentie metingen en het is gefilterd met een smalle band pass interference filter BPF. Een set van vaste en variabele grijsfilters ND in combinatie met de aanwezigheid van een automatische sluiter S laten de hoeveelheid licht op het monster te controleren en houden het laag genoeg om fotobleken te voorkomen. Gelijkmatige verlichting monster wordt verkregen met behulp van een beam expander BE met een gecombineerde twee lenzen Galilea telescoop en een diffuser. Het monster S is ondergedompeld in de clearing-oplossing en wordt gehouden op zijn plaats op een houder en geroteerd langs de verticale as door middel van een snelle rotatie fase (Newport, PR50) met een absolute nauwkeurigheid van 0,05 graden. Drie verschillende handmatige controllers zorgen voor de steekproef verticale as te worden gekanteld en aangepast in het orthogonale vlak. De transilluminatie signaal wordt direct gedetecteerd door de CCD-camera, de fluorescentie-signaal wordt gefilterd door een smalle band-pass interference filter in combinatie met een longpass filter (Omega. Optical, Brattleboro, VT) en vervolgens verzameld met een telecentrische lens TL. Telecentrische objectieven bieden het voordeel van het verstrekken van unieke eigenschappen die maken ze ideaal voor optische projectie tomografie. In feite is de aanwezigheid van een diafragma zich binnen de lens montage in het brandpunt van de lens zorgt ervoor dat stralen, dat het beeld van het diafragma stop te maken, parallel zal reizen naar de optische as waardoor er geen enig perspectief vervorming en het verstrekken van de dezelfde vergroting voor meerdere vlakken binnen de telecentrisch diepte.
Monstervoorbereiding
De volgende procedure wordt gevolgd om de weefsels / organen fix
- Monsters zijn vastgelegd in PFA voor 8 uur bij 4C.
- Monster wordt vervolgens gewassen in PBS gedurende 15 minuten
- Het monster wordt ingebed in een 0,8% agarose blokkeren
- Agarose blok is gedehydrateerd door middel van een serie van 20% tot 100% van ethanol oplossingen. Deze drogen ethanol serie procedure helpt bij het vermijden van asymmetrische krimp van het monster.
- Eindelijk het monster wordt geïncubeerd 10 uur in 100% ethanol om geen water inhoud te verwijderen uit het monster.
- Zet het monster in een oplossing van 1:02 benzylalcohol en Benzyl Benzoate voor de tijd die nodig is om het monster te wissen. Merk op dat de tijd aanzienlijk kunnen verschillen van monster tot monster van een paar uur tot meerdere dagen.
- Ethanol in minimale sporen kunnen aanwezig zijn aan het einde van het clearing proces dat aanleiding geeft tot artefacten scheiden in de reconstructies door thermische beweging van de alcohol in de open plek oplossing zelf. Om dit probleem te voorkomen, een seconde clearing cyclus in aanbevolen.
- Punt 4 en 5 moeten worden uitgevoerd in het donker op een bleken van fluorescerende contrastmiddelen of eiwitten te voorkomen.
Hart Monstervoorbereiding
Het is belangrijk om geen bloed content te verwijderen van elk weefsel voorafgaand aan worden afgebeeld om een hoge absorptie artefacten te vermijden in de reconstructies. De volgende procedure kan worden gevolgd.
- Verdoven van de muis met een intraperitoneaal (IP) injectie van een mengsel van ketamine (90 mg / kg) en xylazine (10mg/kg).
Opmerking: ". Vanaf dit punt houden de steekproef beschermd tegen licht" - Injecteer 50 U van heparine (IP) en vijf minuten later, het uitvoeren van een longitudinale laparotomie.
- Open de linker nier-ader (LRV) en trekken van 20 ml zoutoplossing in het IVC.
- De agarose blok moet worden gedehydrateerd met vier, een uur incubaties, in 20%. 40%, 60% en 80% ethanol, en ten slotte, zijn monsters geïncubeerd in 100% ethanol voor 10 uur ('s nachts).
- Hart is dan vast naar aanleiding van de algemene monstervoorbereiding procedure
Opmerking: ". Vanaf dit punt houden de steekproef beschermd tegen licht"
Absorptie Reconstructies
Reconstructie van optische absorptie in de afwezigheid van verstrooiing zijn in het algemeen analoog aan X-CT en kan worden verkregen met behulp van een gemeenschappelijke gefilterd Radon achtergrondprojectie algoritme. De absorptie beelden worden vervolgens door een CCD-camera in transilluminatie meer dan 360 projecties met een 1 graden langs de verticale as. Het is handig om af te stemmen op de verticale as van het monster parallel aan de kolom van pixels van de CCD.
- Plaats het blok van agarose in een kamer gevuld met de clearing-oplossing
- Verlicht monster met een gerichte lichtstraal voor zowel de excitatie-en transmissie-metingen
- Draai monster meer dan 360 projecties met een 1 graden.
- Acquire afbeeldingen in transilluminatie zowel absorptie (intrinsieke) en fluorescentie golflengten.
- Plaats een sluitertijd tot continue verlichting te vermijden en bleken te verminderen.
- Gebruik afiltered Radon achtergrondprojectie algoritme om tomographically reconstrueren van het monster
Fluorescentie Reconstructies
Het algoritme gebruikt voor de absorptie reconstructies is niet geldig voor de wederopbouw van fluorescentie distributie en, indien geen rekening gehouden, de absorptie bijdrage zal leiden tot ernstige artefacten.
- Verder als beschreven in de "Absoprtion Reconstructies" sectie.
- Verwerven gelijktijdig zowel de absorptie en fluorescentie metingen
- Combineer de gegevens in de genormaliseerde Born veld beelden
- Noteer vergelijkingen van de voorwaartse model van de licht inval voor intrinsieke en fluorescentie golflengten.
- Bereken het gewicht matrix op een gediscretiseerd mesh voor Green's functies van het model naar voren
- Omkeren van het gewicht en de matrix vermenigvuldigen met het gedetecteerde Normalized Born veld beelden aan de wederopbouw van de fluorescentie verdeling te krijgen in het object
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
C. Vinegoni erkent steun van de National Institutes of Health (NIH) subsidie 1-RO1-EB006432.
References
- Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sorensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-544 (2002).
- Lee, K., Avondo, J., Morrison, H., Blot, L., Stark, M., Sharpe, J., Bangham, A., Coen, E. Visualizing plant development and gene in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).
- Oldham, M., Sakhalkar, H., Wang, Y. M., Guo, P. Y., Oliver, T., Bentley, R., Vujaskovic, Z., Dewhirst, M. Three-dimensional imaging of whole rodent organs using optical computed and emission tomography. J. Biomed. Opt. 12, 1-10 (2007).
- Ntziachristos, V., Weissleder, R. Experimental three-dimensional fluorescence reconstruction of diffuse media by use of a normalized Born approximation. Opt. Lett. 26, 893-895 (2001).
