Summary
我々は、撮像された試料の吸収特性のためのアカウントが正確かつ定量的な蛍光トモグラフィー再構成を取得すること（BnOPT）光学投影トモグラフィのために生まれ、正規化手法を提案する。我々は、小動物の臓器内の蛍光分子プローブの分布を再構成するために提案されたアルゴリズムを使用してください。
Abstract
光学投影断層は、最近、主に発生生物学と遺伝子発現研究におけるイメージングツールとして導入された三次元イメージング技術です。テクニックは、最初にそれらを脱水し、ベンジルアルコールと2:1の比（バブやマレーの透明な溶液）中の安息香酸ベンジルの混合物に配置することにより、光学的に透明な生物学的サンプルをレンダリングします。テクニックは、まずベンジルアルコールおよびクリアするために2:1（バブやマレーの透明な溶液）中の安息香酸ベンジルの混合物でそれらを置く段階的エタノール溶液でそれらを脱水することにより光学的に透明な生物試料をレンダリングします。吸収の寄与を完全に排除することができないままクリア処理後の試料の散乱の寄与が大幅に削減し、ほとんど無視できる程度にすることができます。調査中のサンプル内の蛍光分布を再構成しようとすると、この寄与は、画像アーチファクトと定量化誤差に、必然的に、再構成し、リード線に影響を与えます..吸収がクリアメディアの数週間または数ヶ月の永続性をさらに低減することができるが、これは蛍光の進行性消失すると非現実的な長いサンプル処理時間につながる。両方外因性造影剤（分子造影剤）と同様に内因性のコントラスト（遺伝的に発現する蛍光蛋白質の例再建）を再構築するときにこれは本当です。
Protocol
イメージングの手順
実験セットアップを図1に詳細に示されています。光源LSは、吸収測定用の照明として、蛍光測定用の励起源としての両方の役割を果たし、それは狭いバンドパス干渉フィルタBPFでフィルタリングされます。 Sは試料に光の量を制御するために、任意の光退色を防ぐのに十分それを低く維持するための自動シャッターの存在と組み合わせて、固定と可変NDフィルターNDとのセット。均一なサンプルの照明は、ビームエキスパンダは、結合された二つのレンズガリレイ望遠鏡とディフューザーと一緒に使用することによって達成される。試料Sは、清算の溶液に浸漬すると0.05度の絶対精度で高速回転ステージの道（ニューポート、PR50）で、その縦軸に沿ってホルダーと回転を所定位置に保持される。三つの異なるマニュアルコントローラは、その直交する平面に傾斜して調整するサンプル縦軸が可能になります。透視信号を直接CCDカメラで検出され、蛍光シグナルは、テレセントリックレンズTLで収集された後、ロングパスフィルター（Omega.光、ブラトルバロ、バーモント州）と結合し、狭いバンドパス干渉フィルターを通して濾過される。テレセントリックレンズは、光学投影断層撮影にとって理想的な、ユニークな機能を提供する利点を提供します。実際には開口部の存在は、レンズの焦点でのレンズアセンブリ内にある停止には、開口絞りの像を作る光線が、、事実上すべての射影歪みを排除し、同じ倍率を提供する光軸に平行に移動することを保証テレセントリック深さ内の複数の平面のための。
サンプル準備
次の手順は、組織/臓器を固定するために続いて
- サンプルは4℃で8時間PFAで固定されています。
- 次に試料を15分間PBSで洗浄し、
- サンプルを0.8％アガロースブロックに埋め込まれています
- アガロースブロックは、エタノール溶液の20％〜100％のシリーズを通じて、脱水です。この脱水エタノールシリーズの手続きは、サンプルの任意の非対称収縮を避けることに役立ちます。
- 最後に、サンプルは、サンプルからの水分を除去するために、100％エタノールで10時間インキュベートする。
- ベンジルアルコールおよびクリアするためにサンプルに必要な時間のための安息香酸ベンジルのソリューション1:2のサンプルを置く。時間は数時間から数日間にサンプル間でかなり異なることに注意してください。
- 最小限のトレースのエタノールは、クリアリングソリューション自体内でアルコールの熱運動に起因する再構成のアーチファクトを切断を生じさせるクリアプロセスの終了時に存在することができる。推奨でこの問題を回避するためには、第二決済サイクル。
- ポイント4と5は、任意の蛍光造影剤または蛋白質の漂白を避けるために、暗所で実行する必要があります。
心臓サンプルの調製
再建に高い吸収アーチファクトを避けるために撮像される前に任意の組織からの血液のコンテンツを削除することが重要です。次の手順に従うことができます。
- ケタミン（90 mg / kg体重）及びキシラジン（10mg/kgより少ない）のミックスの腹腔内（IP）注射でマウスを麻酔。
注："このポイントから前方にサンプル遮光しておく。" - ヘパリン（IP）の50 Uを注入し、5分後に、長手方向の開腹手術を行います。
- 左腎静脈（LRV）を開き、IVCに生理食塩水の20ミリリットルを吹き込む。
- アガロースブロックは20％で、4つ、一時間のインキュベーションで脱水してください。その後、40％、60％、および80％エタノール、及び、最終的に、サンプルは10時間（一晩）のために100％エタノール中でインキュベートする。
- 心臓は、一般的なサンプル調製手順に従って固定されています
注："このポイントから前方にサンプル遮光しておく。"
吸収の再構成
散乱の非存在下での光吸収の再建は、一般的にはX - CTに類似していると一般的なフィルタリングラドン逆投影アルゴリズムを使用して取得できます。吸収画像は縦軸に沿って1度の角度で360の突起を介して透視でCCDカメラで撮影されています。それは、CCDの画素の列にサンプルの平行の縦軸を揃えると便利です。
- 決済ソリューションで満たされたチャンバーにアガロースのブロックを配置
- 励起測定と伝送測定の両方のための平行ビームで試料を照らす
- 1度の角度で360の突起を介してサンプルを回転させる。
- 吸収（固有）と蛍光波長の両方で透視の画像を取得する。
- 連続照明を避け、漂白を減らすためにシャッターを配置。
- AFを使用してくださいtomographicallyサンプルを再構成するためにilteredラドン逆投影アルゴリズム
蛍光再建
吸収の再建のために使用されるアルゴリズムは、蛍光分布の再建には有効ではありませんし、考慮しない場合、吸収の寄与は、重大なアーティファクトにつながる。
- "Absoprtion再構成"セクションに示されるように進んでください。
- 同時に吸収し、蛍光測定の両方を取得する
- 正規生まれフィールドの画像にデータを組み合わせる
- 内因性および蛍光波長の光伝搬のフォワードモデルの方程式を書き留めます。
- フォワードモデルのグリーン関数のための離散化メッシュにウェイト行列を計算する
- 重み行列を反転し、オブジェクトの蛍光分布の再構成を得るために検出された正規生まれフィールドの画像を掛けます
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
C. Vinegoniは衛生研究所（NIH）助成1 - RO1 - EB006432の国立研究所からの支援を認めている。
References
- Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sorensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-544 (2002).
- Lee, K., Avondo, J., Morrison, H., Blot, L., Stark, M., Sharpe, J., Bangham, A., Coen, E. Visualizing plant development and gene in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).
- Oldham, M., Sakhalkar, H., Wang, Y. M., Guo, P. Y., Oliver, T., Bentley, R., Vujaskovic, Z., Dewhirst, M. Three-dimensional imaging of whole rodent organs using optical computed and emission tomography. J. Biomed. Opt. 12, 1-10 (2007).
- Ntziachristos, V., Weissleder, R. Experimental three-dimensional fluorescence reconstruction of diffuse media by use of a normalized Born approximation. Opt. Lett. 26, 893-895 (2001).
