Summary
Wir empfehlen Ihnen einen Born normalisierten Ansatz für Optical Projection Tomographie (BnOPT), die für die Absorptionseigenschaften des abgebildeten Proben Konten, um genaue und quantitative Fluoreszenz-tomographischen Rekonstruktionen zu erhalten. Wir verwenden den vorgeschlagenen Algorithmus, um die Fluoreszenz molekulare Sonde Verteilung innerhalb kleiner tierischer Organe zu rekonstruieren.
Abstract
Optische Projektions-Tomographie wird ein dreidimensionales bildgebendes Verfahren, das erst kürzlich als Imaging-Tool vor allem in der Entwicklungsbiologie und der Genexpression Studien eingeführt. Die Technik macht biologischen Probe optisch transparent, indem Sie zunächst entwässert und dann zur Überführung in eine Mischung aus Benzylalkohol und Benzylbenzoat in einem Verhältnis von 2:1 (BABB oder Murray s Klare Lösung). Die Technik macht biologischen Proben optisch transparent, indem Sie zunächst entwässert in abgestuften Ethanollösungen sie dann in eine Mischung aus Benzylalkohol und Benzylbenzoat in einem Verhältnis von 2:1 (BABB oder Murray s Klare Lösung) zu klären. Nach dem Clearing-Verfahren der Streuung Beitrag in der Probe kann stark reduziert werden und machte fast vernachlässigbar, während die Absorption Beitrag kann nicht vollständig ausgeschlossen werden. Beim Versuch, die Fluoreszenz-Verteilung innerhalb der zu untersuchenden Probe zu rekonstruieren, wirkt sich dieser Beitrag die Rekonstruktionen und führt zwangsläufig zu Bildartefakte und Quantifizierung Fehler .. Während Absorption konnte weiter mit einer Dauer von Wochen oder Monaten in der Lichtung Medien reduziert werden, wird dies zu einem fortschreitenden Verlust der Fluoreszenz und eine unrealistisch lange Probe Bearbeitungszeit führen. Dies gilt sowohl bei der Rekonstruktion exogenen Kontrastmitteln (molekulare Kontrastmittel) sowie endogene Kontrast (zB Rekonstruktionen von gentechnisch ausgedrückt fluoreszierenden Proteinen).
Protocol
Bildgebendes Verfahren
Der Versuchsaufbau ist im Detail in Abbildung 1 dargestellt. Eine Lichtquelle LS dient sowohl als Beleuchtung für Absorptionsmessungen und als Anregungsquelle für Fluoreszenz-Messungen und es ist mit einem schmalen Bandpass-Interferenzfilter BPF gefiltert. Eine Reihe von festen und variablen Neutralfilter ND mit dem Vorhandensein einer automatischen Blende S ermöglichen, die Menge an Licht auf die Probe zu kontrollieren und halten Sie sie niedrig genug, um jede Ausbleichen zu verhindern kombiniert. Uniform Probe Beleuchtung ist mit einem Beam Expander mit einem kombinierten zwei Linsen Galilei-Teleskop und einem Diffusor erreicht werden. Die Probe S wird in der Clearing-Lösung getaucht und in Stelle auf einer Halterung gedreht und entlang der vertikalen Achse durch eine hohe Drehzahl Stufe (Newport, PR50) mit einer absoluten Genauigkeit von 0,05 Grad gehalten werden. Drei verschiedene manuelle Steuerungen ermöglichen die Probe vertikale Achse zu kippen und in ihrer orthogonalen Ebene angepasst werden. Die Durchleuchtung wird direkt von der CCD-Kamera detektiert, die Fluoreszenz-Signal wird durch einen engen Bandpass-Interferenzfilter mit einer Langpassfilter (omega Optical, Brattleboro, VT) und dann gesammelt mit einem telezentrischen Objektiv TL gekoppelt gefiltert. Telezentrische Objektive bieten den Vorteil, dass einzigartige Eigenschaften, die sie ideal für optische Projektion Tomographie machen. In der Tat das Vorhandensein einer Aperturblende befindet sich innerhalb der Linse Montage im Brennpunkt der Linse gewährleistet, dass Strahlen, die das Bild der Aperturblende zu machen, wird parallel reisen, um die optische Achse wird praktisch nicht perspektivischer Verzerrung und die Bereitstellung der gleichen Vergrößerung für mehrere Ebenen innerhalb der telezentrische Tiefe.
Probenvorbereitung
Das folgende Verfahren eingehalten wird, um dem Gewebe / Organe fix
- Die Proben werden in PFA 8 Stunden bei 4C fixiert.
- Die Probe wird dann in PBS für 15 Minuten gewaschen
- Die Probe wird in einem 0,8% Agarose-Block eingebettet
- Agarose Block dehydriert ist durch eine Reihe von 20% bis 100% der Ethanol-Lösungen. Diese Dehydratisierung Ethanol-Serie Verfahren hilft bei der Vermeidung jeglicher asymmetrischen Schrumpfung der Probe.
- Schließlich wird die Probe 10 Stunden in 100% Ethanol inkubiert, um etwaige Wassergehalt der Probe zu entfernen.
- Legen Sie die Probe in eine Lösung 1:2 in Benzylalkohol und Benzylbenzoat für die notwendige Zeit für die Probe klar. Beachten Sie, dass die Zeit kann stark variieren von Probe zu Probe von wenigen Stunden bis zu mehreren Tagen.
- Ethanol in geringen Spuren werden am Ende des Clearing-Prozesses, die zu Artefakten in den Rekonstruktionen aufgrund der thermischen Bewegung der Alkohol in der Clearing-Lösung selbst lösen zu präsentieren. Um dieses Problem zu vermeiden, ein zweites Clearing-Zyklus in empfohlen.
- Punkt 4 und 5 sollten in der Dunkelheit durchgeführt werden, um Bleichen von fluoreszierenden Kontrastmittel oder Proteine zu vermeiden.
Herz Probenvorbereitung
Es ist wichtig, um das Blut der Content aus allen Geweben vor abgebildet, um eine hohe Absorption Artefakte in der Rekonstruktion zu vermeiden entfernen. Das folgende Verfahren verfolgt werden kann.
- Anesthetize die Maus mit einem intraperitoneal (IP) Injektion einer Mischung aus Ketamin (90 mg / kg) und Xylazin (10mg/kg).
Hinweis: ". Von diesem Zeitpunkt an halten die Probe vor Licht geschützt" - Inject 50 U Heparin (IP) und fünf Minuten später, führen Sie eine Längs-Laparotomie.
- Öffnen Sie die linke Nierenvene (LRV) und ziehen 20ml Kochsalzlösung in die IVC.
- Die Agarose-Block sollte entwässert werden mit vier, eine Stunde Inkubationen in 20%. 40%, 60% und 80% Ethanol und schließlich werden die Proben in 100% Ethanol für 10 Stunden (über Nacht) inkubiert.
- Das Herz ist dann im Anschluss an die allgemeine Probenvorbereitung festen
Hinweis: ". Von diesem Zeitpunkt an halten die Probe vor Licht geschützt"
Absorption Rekonstruktionen
Rekonstruktion der optischen Absorption in der Abwesenheit von Streuung sind in der Regel analog zu X-CT und kann unter Verwendung eines gemeinsamen gefiltert Radon Rückprojektion Algorithmus. Die Absorption Bilder werden dann von einer CCD-Kamera im Durchlicht genommen über 360 Projektionen mit einem 1-Grad-Winkel entlang der vertikalen Achse. Es ist zweckmäßig, um die vertikale Achse der Probe parallel zur Säule der Pixel des CCD auszurichten.
- Den Block der Agarose in eine Kammer mit Clearing-Lösung gefüllt
- Illuminate Probe mit einem gebündelten Strahl für beide Anregungs-und Transmissionsmessungen
- Drehen Probe über 360 Projektionen mit einem 1-Grad-Winkel.
- Erwerben Sie Bilder in Durchleuchtung sowohl Absorption (intrinsische) und Fluoreszenz-Wellenlängen.
- Legen Sie einen Auslöser, um kontinuierliche Beleuchtung zu vermeiden und zu reduzieren Bleichen.
- Verwenden Sie afiltered Radon Rückprojektion Algorithmus tomographisch rekonstruieren die Probe
Fluoreszenz-Rekonstruktionen
Der Algorithmus für die Absorption Rekonstruktionen verwendet wird, nicht gültig für den Wiederaufbau der Fluoreszenz Verteilung und, wenn nicht berücksichtigt wird, die Absorption Beitrag wird zu schweren Artefakten führen.
- Gehen Sie wie in der "Absoprtion Rekonstruktionen" aufgeführt werden.
- Erwerben Sie gleichzeitig sowohl Absorption und Fluoreszenz-Messungen
- Kombinieren Sie die Daten in der normierten Born Bereich Bilder
- Schreiben Sie Gleichungen des vorderen Modell der Lichtausbreitung für intrinsische und Fluoreszenz-Wellenlängen.
- Berechnen Gewicht Matrix auf eine diskretisierte Mesh für Green-Funktionen des vorderen Modell
- Kehren Sie die Gewichtsmatrix und multipliziere es mit der erkannten Normalized Born-Bildern für den Wiederaufbau der Fluoreszenz Verteilung in das Objekt zu erhalten
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Acknowledgments
C. Vinegoni dankt für die Unterstützung von National Institutes of Health (NIH) gewähren 1-RO1-EB006432.
References
- Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sorensen, J., Baldock, R., Davidson, D. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-544 (2002).
- Lee, K., Avondo, J., Morrison, H., Blot, L., Stark, M., Sharpe, J., Bangham, A., Coen, E. Visualizing plant development and gene in three dimensions using optical projection tomography. Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).
- Oldham, M., Sakhalkar, H., Wang, Y. M., Guo, P. Y., Oliver, T., Bentley, R., Vujaskovic, Z., Dewhirst, M. Three-dimensional imaging of whole rodent organs using optical computed and emission tomography. J. Biomed. Opt. 12, 1-10 (2007).
- Ntziachristos, V., Weissleder, R. Experimental three-dimensional fluorescence reconstruction of diffuse media by use of a normalized Born approximation. Opt. Lett. 26, 893-895 (2001).
