Summary
우리는 시험 관내 CNS 축삭 - glia의 상호 작용 연구를위한 새로운 다중 구획 신경 공동 문화 microsystem 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 병렬 여섯 독립적인 실험까지 실시 수 있으며, 새로 개발된 마이크로 / 매크로 하이브리드 제조 방법을 사용하여 가공했습니다.
Abstract
우리는 더 높은 처리량을위한 병렬 여섯 독립적인 실험까지 수행 능력이 체외의 CNS에서 축삭 - glia 상호 작용 연구를위한 새로운 다중 구획 신경 공동 문화 microsystem 플랫폼을 제시한다. 우리는 좋은 repeatability와 대량 제조를 가능하게 한 부드러운 리소그래피 프로세스를 통해 동일한 장치 내에서 마이크로 및 매크로 모두 규모 구조를 가지고 microfluidic 장치를 만들 수있는 새로운 제조 방법을 개발했습니다.
다중 구획 microfluidic 공동 문화 플랫폼 oligodendrocytes (OLs)의 뉴런 여섯 축삭 / glia 구획 하나의 소마 구획으로 구성되어 있습니다. 소마 구획 및 축삭 / glia 구획은의 배열에 의해 연결되어 있습니다 축삭 -지도 microchannels 그 axons은 축삭 / glia의 구획으로 성장할 수 있도록하면서 물리적 장벽이 소마 구획에의 연결 소마 범위를 제한하는 등 기능을 수행합니다. 축삭 / glia 구획에 로드된 OLs은화된 축삭 - glia 상호 작용 연구를 활성화, axons과 함께하지만 소마의 연결 또는 dendrites에만 연계해서 실행할 수 있습니다. microchannels은 또한 6 독립적인 실험이 더 높은 처리량을위한 단일 장치에서 실시 수 있도록, 구획 사이에 유체 절연을 활성화.
폴리 (dimethylsiloxane) (PDMS)을 사용하여 소프트 리소그래피는 생물 의학 microdevices에서 일반적으로 사용되는 기법입니다. 이러한 장치에 대한 저수지는 일반적으로 수동 펀칭에 의해 정의됩니다. 간단 가난한 정렬 및 프로세스의 시간이 소요되는 자연은 저수지 많은 수의 반복 작성해야 할 때이 과정이 적합하지합니다. 있지만 새로 개발된 방법은 이러한 한계를 극복, 저수지의 수동 펀칭을 필요로하지 않았다. 첫 번째, 일곱 저수지 (깊이 : 3.5 mm)는 마이크로 밀링 머신을 사용하여 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트) (PMMA) 블록에되었다. 그런 다음, 유리 기판에 대한 조작 리지 microstructures의 배열은, 소마와 축삭 / glia 구획을 연결 microchannels을 정의하는 PMMA 블록에 대한 핫 - 양각되었다. 이 프로세스는 하나의 PMMA 마스터 내에서 일치하는 매크로 규모의 저수지 (3.5 ㎜)와 마이크로 규모의 채널 (2.5 μm의) 결과. 금형 마스터 역할을 PDMS 복제는 소프트 리소그래피와 최종 PDMS 장치가이 마스터에서 복제되었다를 사용하여 얻은 것입니다.
E16 - 18 쥐의 기본 뉴런은 소마의 구획을 읽어 두 주 동안 교양되었습니다. 세포 배양 후 일주일 후, axons가 microchannels를 건너와 축삭 / glia 구획 안에 axonal는 네트워크 계층을 형성했다. Axons은 P1 - 2 쥐 6 축삭 / glia 구획 및 OLs에 걸쳐 균일하게 성장은 공동 문화 체외에 14 일 동안 축삭 / glia 구획에 추가되었습니다.
Protocol
1 부 : 다중 구획을위한 마스터 몰드를 준비 신경 세포 공동 배양 장치 제작
- PMMA 마스터를 조작하는 첫 번째 단계는 3.5 mm 깊이 구획을하는 것입니다. 한 소마 구획 여섯 축삭 / glia 구획은 마이크로 밀링 머신 (MDX - 40, 롤랜드 또는 기타 CNC 밀링 머신)을 사용하여 PMMA 블록에 정의됩니다. PMMA 마스터는 다음 파편을 제거하는 10 분 동안 이소 프로필 알코올에 sonicated됩니다.
- 2.5 μm의 하이 리지 구조의 배열은 유리의 서부 유럽 표준시 에칭 다음 표준 석판술 프로세스에 의해 50.8 mm X 50.8 mm 유리 슬라이드에 패턴입니다.
첫째, 리지 구조의 배열 석판술를 사용하여 긍정적인 포토 레지스트 S1818과 함께 청소를 유리 기판에 패턴입니다. S1818은 110을 기반으로 부드러운 기판 (4000 RPM)에 스핀 - 코팅 ° 후 5 분 C 및 40 MF319에 포토 레지스트의 개발하여 다음 마스크 aligner를 사용하여 자외선 (84 MJ / cm 2)에 노출 초. 다음, 포토 레지스트 패턴 유리 기판은 2.5 μm의 톨 리지 구조를 얻기 위해 6-7분 위해 상온에서 산화 에칭 버퍼 (BOE)에 포장되어 있습니다. 마지막으로 포토 레지스트 층 드 이온화 (DI) 물에 rinsing 철저한 다음, 아세톤과 이소 프로필 알코올에 의해 제거됩니다. - 마이크로 리지 구조와 유리 기판의 패턴을 전송하는 PMMA 마스터에 대한 핫 - 양각입니다.
첫째, PMMA의 금형 마스터와 유리 기판은 수동 정렬 및 핫 언론에 게재됩니다. 그러면, 온도가 115로 올랐을 ° C. 일단 원하는 온도 중량 0.5 톤 5 분 적용, 도달합니다. 5 분 후에, 온도는 40 ° C와 압력이 릴리스로 냉각합니다. PMMA 마스터는 다음 50.8 mm X 50.8 mm 크기의 블록으로 절단됩니다. - 무게 : 1 PDMS 사전 중합체 (Sylgard 184은) 10의 비율로 치료 요원과 함께 혼합됩니다.
- PMMA 마스터는 캐스크와 PDMS 혼합물은 PDMS 마스터를 조작하는 PMMA 마스터 위에 부어 안에 있습니다. 그것은 다음 진공 펌프에 연결된 건조기에 배치됩니다. PDMS 다음 PDMS 믹싱 과정에서 발생하는 거품을 제거하는 15 분 동안 degassed입니다 PMMA 마스터 위에 부어.
- 모든 거품을 제거하는 경우, PDMS는 중합 한 시간 동안 뻗었 85 ° C 오븐 안에 넣어 수 있습니다.
- 일단 PDMS이 완전히 치료되어 PDMS 마스터는 PMMA 마스터에서 출발 벗겨 trichlorosilane로부터 2-3 방울과 건조기 안에와 수증기 코팅 15 분 PDMS 마스터 표면을 위해 진공 청소기로 청소를합니다. Trichlorosilane 코팅은 PDMS 마스터에서 최종 PDMS 신경 세포 공동 배양 장치의 릴리스를 용이하게합니다. 코팅 후, PDMS 마스터는 간단히 과도한 trichlorosilane을 제거하는 이소 프로필 알코올로 씻어서이며, N 2 가스로 건조.
2 부 : 뉴런 문화 장치 복제
- 무게 : 1 PDMS 사전 중합체 (Sylgard 184은) 10의 비율로 치료 요원과 함께 혼합됩니다.
- PDMS 혼합물의 PDMS 마스터 위에 붓고 15 분 동안 진공 펌프에 연결된 건조기 내부 degassed입니다. 이것은 마스터에서 3.5 mm 높은 PDMS의 구조가 완전히 잠겨되지 않도록 너무 PDMS 잔하지 않는 것이 중요합니다.
- 모든 거품을 제거하는 경우, PDMS는 중합 한 시간 동안 뻗었 85 ° C 오븐 안에 넣어 수 있습니다.
- PDMS 한 시간 후 오븐에서 제거하고 진정 실온에서 왼쪽입니다. 그런 다음, PDMS 뉴런 문화 장치 부드럽게 PDMS 마스터에서 해제 벗겨 수 있습니다. PDMS 장치 해제 벗겨 먼지 또는 파편으로부터 그들을 보호하기 위해 parafilm으로 싸여있다.
- parafilm과 포장 PDMS 기기, 블레이드 장착된 드릴 프레스를 사용하여 개별 조각으로 절단됩니다.
제 3 부 : 장치 조립
- PDMS 뉴런 문화 장치는 플라즈마 청소기 내부 배치와 PDMS 장치의 표면이 친수성 만들어 90 초 동안 공기 플라즈마에 노출됩니다. 이 플라즈마 처리는 폴리 - D - 라이신 코팅 기판에 조립 후 문화 매체와 기입에 microchannels를 촉진합니다.
- 플라즈마로 처리 장치는 다음 살균을 위해 30 분 동안 70 %의 에탄올에 열중하고 소독 바이오 후드 안쪽 이동됩니다.
- 멸균 장치는 70 % 에탄올에서 제거하고 Millipore 여과 N 2 가스로 건조됩니다. 말린 디바이스는 6 잘 문화 플레이트와 부드러운 압력이 기판과 장치 사이의 밀봉을 보장하기 위해 적용되는 폴리 - D - 라이신 코팅 폴리스티렌 상단에 표시됩니다.
- 문화 미디어 다음 여섯 축삭 / glia 구획을 작성하여 다음, 소마 짐칸에 가득 차 있습니다. 이것은 거품이 microchannels 내에 갇혀되지 않습니다 않도록 소마의 구획으로 문화 미디어를 삽입한 후 축삭 / glia 구획을 작성하기 전에 1~2분에게 주저하는 것이 좋습니다.
- 문화 미디어로 가득 장치는 37 가능한 모든 이물질이나 독성 잔류물을 씻어하기 ° C 배양기 안에서 하룻밤 incubated입니다.
4 부: 셀 로딩 및 신경 세포 - oligodendrocyte 공동 문화
- 세포 배양의 첫 날, 배아 날부터 기본 forebrain의 신경 세포는 16-18 쥐 500 세포 / mm 2 면적 밀도에서 소마 짐칸에로드됩니다. 첫째, 소마 구획 및 축삭 / glia 구획 모두 내부 문화 미디어는 이전의 셀 로딩에 피펫을 사용하여 aspirated 있습니다. 그런 다음, 문화 미디어 40 μl에 희석 38,500 전지는, microchannel 인레츠 주변의 소마 구획에로드됩니다. 그것은 장치와 기판 사이의 봉인을 깰 수 있기 때문에 그것은 세포를 로딩하는 동안 PDMS 장치를 만지지 않는 것이 중요합니다.
- 기판에 세포 부착을 향상시키기 위해 37 ° C 배양기 안에서 30 분 동안 셀 로드된 장치를 품어. 부화 후, 모든 구획은 문화 미디어로 가득 차 있습니다.
- 전지는 37 양식 아르 ° humidified 5% CO 2 배양기에서 C 및 문화 매체의 절반 밖에이 모든 3~4일 밖으로 변경됩니다.
- 체외에서 신경 세포 문화 날로부터 14 일 후, oligodendrocytes가 공동 문화 축삭 / glia 구획에 추가됩니다. 출생 후의 일 1-2에서 스프 라그 - 돌리 쥐의 대뇌 반구의 해부 Oligodendrocytes은 1000 셀 / mm 2 면적 밀도 각 축삭 / glia 구획에 추가됩니다. 이전 로딩 세포로 구획 내부 문화 미디어의 약 60 %는 피펫과 aspirated 있습니다. 이 기판에 형성 axonal 네트워크를 손상 수 있기 때문에주의가 바닥 기판을 만지지 않도록하셔야합니다. 그런 다음, 문화 미디어 5 μl에 희석 6,700 oligodendrocyte 세포, 축삭 / glia 구획에 추가됩니다. 세포는 1 시간 동안 incubated하고 구획은 문화 미디어로 가득 차 있습니다.
- 전지는 37 양식 아르 ° humidified 5% CO 2 인큐베이터에만 문화 미디어의 절반이 두 주 동안 매일 3-4일 밖 변경에 C.
제 5 부 : 대표 결과 :
실험이 제대로 수행되면 소마 구획에 로드된 신경 세포는 문화의 일주 후 축삭 / glia 구획 내부 형태로 시작 가까운 microchannel 인레츠 및 axonal 레이어 찾을 수 없습니다. 소마 구획 내부에 신경 세포의 집합의 로그인 세포가 건강하지 않는 표시하실 수 있습니다. 신경 세포 문화의 2 주 후에 oligodendrocytes를 로드할 때, 축삭 / glia 구획을 axons와 oligodendrocytes의 밀도 층으로 덮여 있어야이 axonal 레이어 위에 적재해야합니다.
그림 1. 높은 처리량 microfluidic 다중 구획 CNS 신경 공동 문화 플랫폼의 도식 그림. 소마의 연결 및 dendrites뿐만 아니라 분 유체 수준의 차이와 구획 사이의 유체 고립에서 axons의 고립을 보여주는 교차 단면 볼 수 있습니다. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 2. 제작 및 다중 구획을 위해 조립 단계 PDMS microfluidic 공동 문화 장치. 각 장치는 종래의 6 자 폴리스티렌 세포 배양 접시 하나에 잘 맞는 데요. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
우리는 포유 동물 CNS 축삭 - glia 상호 작용을 연구를위한 다중 구획 공동 문화 플랫폼을 개발했습니다. CNS의 axons가 성공적으로 세포의 연결 기관 / dendrites과 격리되어 있었고, oligodendrocytes가 성공적으로 장치 내부에 공동 교양되었습니다. 신경 세포 밀도는 애플 리케이션에 의해 변경될 수 있지만, 너무 낮게 또는 너무 높은 농도는 세포가 죽는 원인이 될 수 있습니다. 또한, 기판의 셀 또는 axonal 레이어가 손상되지 않도록 문화 미디어의 절반 밖에를 변경하는 것이 중요합니다. 우리는이 시스템 CNS 축삭 - glia은 체외에서 네트워크 신호를 공부를위한 강력한 도구와 myelination와 myelin 복구를 촉진 심사 성장 요인 또는 잠재 약물 후보에 대한 높은 처리량 플랫폼을위한 경로를 제공하는 것으로 기대합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
이 작품은 정신 건강 보건 / 국립 연구소 (NIH / NIMH)의 국립 연구소 # 1R21MH085267을 부여하여 지원했다.
References
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. 6, 683-690 (2005).
- Xia, Y., Whitesides, G.
- Taylor, A. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Methods. 2, 599-605 (2005).
- Li, J., Baud, O., Vartanian, T., Volpe, J. J., Rosenberg, P. A., A, P. Peroxynitrite generated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase mediates microglial toxicity to oligodendrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 9936-9941 (2005).
