Summary
פיתחנו רומן רב תא שיתוף תרבות נוירון פלטפורמה עבור microsystem ב CNS מחקר במבחנה אינטראקציה האקסון, גליה. פלטפורמה המסוגלת לנהל עד שישה ניסויים עצמאיים במקביל היה מפוברק באמצעות פיתח מאקרו / מיקרו שיטת ייצור כלאיים.
Abstract
אנו מציגים רומן תא רב שיתוף תרבות נוירון microsystem פלטפורמה למחקר האקסון גליה ב-CNS במבחנה אינטראקציה, המסוגלת לנהל עד שישה ניסויים עצמאיים במקביל עבור תפוקה גבוהה יותר. פיתחנו שיטת ייצור חדשים כדי ליצור התקנים microfluidic שיש מבנים בקנה מידה הן מיקרו ומקרו בתוך המכשיר אותו באמצעות תהליך רך ליתוגרפיה יחיד, מה שמאפשר ייצור המוני עם הדירות טוב.
תא רב פלטפורמת microfluidic שיתוף תרבות מורכבת במדור אחד עבור סומה נוירונים ושישה האקסון / גליה מדורים oligodendrocytes (OLS). תא סומה האקסון ו / גליה תאים המחוברים באמצעות מערכים של האקסון, המנחה microchannels המתפקדים מחסומים פיזיים להגביל סומה עצבי בתא סומה, תוך מתן אפשרות האקסונים לגדול לתוך האקסון / תאים גליה. OLS נטען לתוך האקסון / גליה תאים יכולים לתקשר רק עם אקסונים אך לא עם סומה או דנדריטים עצביים, מה שמאפשר מקומי האקסון, גליה מחקרים אינטראקציה. Microchannels גם איפשר הבידוד fluidic בין תאים, המאפשר six ניסויים עצמאיים להתנהל על התקן יחיד עבור תפוקה גבוהה יותר.
רכים ליתוגרפיה באמצעות פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) היא טכניקה הנמצאת בשימוש נפוץ microdevices ביו. מאגרים על מכשירים אלה מוגדרים בדרך כלל על ידי ניקוב ידני. למרות יישור פשוטים, עניים הטבע זמן רב של התהליך עושה את התהליך הזה אינו מתאים כאשר מספר גדול של מאגרי יש ליצור שוב ושוב. השיטה החדשה שפותחה לא דורשים ניקוב ידני של מאגרים, להתגבר על מגבלות כאלה. ראשית, שבעה מאגרי מים (עומק: 3.5 מ"מ) נעשו על בלוק פולי (PMMA) (methacrylate מתיל) באמצעות מכונת כרסום מיקרו. ואז, מערכים של microstructures רכס, מפוברק על מצע זכוכית, היו חמים בולטות נגד בבלוק PMMA להגדיר microchannels המחברים את סומה ואת האקסון / גליה תאים. תהליך זה הביא המאקרו היקף המאגרים (3.5 מ"מ) ומיקרו בקנה מידה ערוצים (2.5 מיקרומטר) כדי לחפוף בתוך מאסטר PMMA יחיד. העתק PDMS ששימש מאסטר עובש הושג באמצעות רך ליתוגרפיה והמכשיר הסופי PDMS היה משוכפל מן האדון הזה.
נוירונים ראשי מ E16-18 חולדות הועמסו לתא סומה ותרבותי במשך שבועיים. לאחר שבוע של תרבית תאים, אקסונים חצה microchannels והקימו רשת axonal שכבת רק בתוך האקסון / גליה תאים. אקסונים גדל באופן אחיד במשך שש האקסון / גליה תאים ו OLS מ P1-2 חולדות נוספו האקסון / גליה תאים ב 14 ימים במבחנה לתרבות משותפת.
Protocol
חלק 1: הכנת תבנית אב תא רב נוירון שיתוף התרבות ייצור המכשיר
- צעד ראשון לפברק האב PMMA הוא להפוך תאים 3.5 מ"מ עמוק. אחת תא סומה ושישה האקסון / גליה תאים מוגדרים על בלוק PMMA באמצעות כרסום מיקרו מכונה (MDX-40, רולנד או כל מכונת כרסום CNC אחרים). PMMA המאסטר sonicated אז במשך 10 דקות כדי להסיר שאריות של אלכוהול איזופרופילי.
- מערכים של מבנים 2.5 מיקרומטר רכס גבוה הם בדוגמת על 50.8 מ"מ x 50.8 מ"מ זכוכית שקופית בתהליך photolithography סטנדרטי, ואחריו תחריט רטוב של הזכוכית.
ראשית, מערך של מבנים רכס הם בדוגמת על מצע זכוכית לנקות עם חיובי photoresist S1818 באמצעות photolithography. S1818 היא ספין מצופים על פני המצע (4,000 סל"ד), רך מבוסס על 110 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן נחשף לאור UV (84 mJ / cm 2) בעזרת aligner המסכה ואחריו פיתוח של photoresist ב MF319 עבור 40 שניות. בשלב הבא, המצע בדוגמת photoresist זכוכית שקוע תחמוצת שנאגרו לחרוט (BOE) בטמפרטורת החדר למשך 6-7 דקות כדי לקבל 2.5 מיקרומטר מבנים רכס גבוה. לבסוף, שכבת photoresist יוסר על ידי אצטון ואלכוהול איזופרופיל, ואחריו שטיפה יסודית במים (DI) דה מיונן. - מצע זכוכית עם מיקרו רכס מבנים הוא חם בולטות נגד המאסטר PMMA להעביר את דפוסי שלה.
ראשית, אדון PMMA עובש מצעים זכוכית מיושרים ידני והניח על העיתונות חם. ואז, הטמפרטורה עולה על 115 ° C. לאחר הטמפרטורה הרצויה היא הגיעה, 0.5 טון משקל מוחל במשך 5 דקות. אחרי 5 דקות, הטמפרטורה הוא מקורר עד 40 ° C והלחץ הוא שוחרר. האדון PMMA הוא חתך ואז לתוך 50.8 מ"מ x 50.8 מ"מ גודל הבלוק. - PDMS מראש פולימר (Sylgard 184) מעורבב עם סוכן ריפוי ביחס של 10: 1 לפי משקל.
- PMMA מאסטר ממוקם בתוך חבית תערובת PDMS הוא שפך על גבי האב PMMA לפברק מאסטר PDMS. זה ממוקם אז ייבוש המחובר משאבת ואקום. PDMS שפכו על גבי PMMA המאסטר degassed אז במשך 15 דקות כדי להסיר בועות שנוצר במהלך תהליך PDMS ערבוב.
- כאשר כל הבועות מוסרים, PDMS מכניסים לתנור מפולס 85 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת של פילמור.
- ברגע PDMS הוא נרפא לחלוטין, PDMS הראשי הוא קילף מן האב PMMA והניח בתוך תא ייבוש עם 2-3 טיפות trichlorosilane ושאבתי במשך 15 דקות עד אדי המעיל פני האדון PDMS. ציפוי Trichlorosilane מאפשר את שחרורו של האחרון PDMS נוירון שיתוף התרבות התקנים מן האדון PDMS. לאחר ציפוי, המאסטר PDMS היא שטפה בקצרה עם אלכוהול איזופרופילי להסיר trichlorosilane מוגזם, מיובש עם הגז N 2.
חלק 2: התקן Neuron שכפול תרבות
- PDMS מראש פולימר (Sylgard 184) מעורבב עם סוכן ריפוי ביחס של 10: 1 לפי משקל.
- תערובת PDMS הוא שפך על גבי האב PDMS ו degassed בתוך תא ייבוש המחובר משאבת ואקום במשך 15 דקות. חשוב לא לשפוך PDMS יותר מדי, כך מבנה גבוה 3.5 מ"מ PDMS הבסיס אינו שקוע לחלוטין.
- כאשר כל הבועות מוסרים, PDMS מכניסים לתנור מפולס 85 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת של פילמור.
- PDMS מוציאים מהתנור אחרי שעה והשאיר בטמפרטורת החדר כדי להתקרר. ואז, PDMS מכשירים נוירון תרבות הם קלופים בעדינות מן האדון PDMS. קילף מכשירים PDMS הם עטופים עם parafilm כדי להגן עליהם מפני dusts או פסולת.
- PDMS התקנים, עטוף parafilm, הם לחתוך לחתיכות בודדים באמצעות מקדחה מצויד בסכין.
חלק 3: התקן הרכבה
- PDMS מכשיר נוירון תרבות ממוקם בתוך שואב פלזמה חשוף לאוויר פלזמה למשך 90 שניות כדי להפוך את פני השטח של המכשיר PDMS הידרופילי. טיפול זה יקל פלזמה microchannels להתמלא התקשורת בתרבות לאחר ההרכבה למצע poly-d-ליזין מצופה.
- התקנים שטופלו פלזמה שקועים אז במשך 30 דקות עבור עיקור באתנול 70% ועבר בתוך מכסה המנוע ביו מעוקרים.
- מכשירים מעוקרות לקוחים מתוך אתנול 70% מיובשים עם גז Millipore מסונן 2 N. מכשירים יבשים ממוקמים על גבי קלקר poly-d-ליזין מצופה 6-גם צלחת תרבות לחץ עדין מוחל על מנת להבטיח את החותם בין המצע לבין המכשיר.
- תרבות התקשורת מלאה אז לתא סומה, ואחריו ממלאים את ששת האקסון / גליה תאים. עדיף לתת 1-2 דקות הפסקה לפני מילוי האקסון / גליה תאים לאחר הוספת התקשורת בתרבות לתא סומה, כדי לוודא ששום בועות לכודים בתוך microchannels.
- התקנים מלא עם התקשורת התרבות היא מודגרות בתוך 37 ° C חממה לילה לשטוף כל פסולת אפשרית או שאריות רעילים.
חלק 4: Cell העמסה נוירון-oligodendrocyte שיתוף תרבות
- ביום הראשון של התרבות תאים, התאים העיקריים forebrain נוירון מיום עובריים 16-18 חולדות נטענים לתוך תא סומה בצפיפות אזוריות של 500 תאים / מ"מ 2. ראשית, התקשורת והתרבות בתוך תא הן סומה האקסון ו / גליה תאים הם aspirated בעזרת פיפטה לפני טעינת התא. לאחר מכן, התאים 38500, בדילול מלא μl 40 של מדיה תרבות, נטענים לתא סומה סביב פתחי הכניסה microchannel. חשוב לא לגעת במכשיר PDMS בעת טעינת התאים, שכן הוא יכול לשבור את החותם בין המכשיר לבין המצע.
- דגירה מכשירים סלולריים נטען במשך 30 דקות בתוך 37 ° C חממה כדי לשפר את הידבקות התא למצע. לאחר דגירה, תאים כל התמלא התקשורת והתרבות.
- הם תאים בתרבית בשעה 37 ° C ב humidified 5% CO 2 באינקובטור ורק מחצית התקשורת בתרבות משתנה החוצה כל 3-4 ימים.
- לאחר 14 ימים של תרבות נוירון במבחנה, oligodendrocytes מתווספים האקסון / גליה תאים לתרבות משותפת. Oligodendrocytes, גזור מן אונות המוח של חולדות Sprague-Dawley ביום הלידה 1-2, מתווספים תא האקסון / גליה כל בצפיפות על שטח של 1000 תאים / מ"מ 2. לפני טעינת תאים, כ 60% של התקשורת בתרבות בתוך תאים הם aspirated עם פיפטה. זהירות חייב להיעשות לא לגעת המצע התחתונה, שכן הוא יכול לגרום נזק רשת axonal נוצרו על פני המצע. לאחר מכן, 6700 תאים oligodendrocyte, בדילול מלא μl 5 של התקשורת בתרבות, מתווספים אל האקסון / גליה תאים. תאים מודגרת במשך שעה 1 ו - תאים מלאים עם התקשורת והתרבות.
- הם תאים בתרבית בשעה 37 ° C ב humidified 5% CO 2 באינקובטור ורק מחצית התקשורת בתרבות משתנה החוצה כל 3-4 ימים במשך שבועיים נוספים.
חלק 5: תוצאות נציג:
כאשר הניסויים מתבצעים כראוי, תאים הנוירון טעון לתא סומה לאתר קרוב פתחי הכניסה microchannel שכבת axonal להתחיל לגבש בתוך האקסון / גליה תאים לאחר שבוע 1 של התרבות. סימן צבירה תא עצב בתוך תא סומה יכול להיות אינדיקציה לכך התאים אינם בריאים. בעת טעינת oligodendrocytes לאחר שבועיים של תרבות נוירון, האקסון / גליה תאים צריך להיות מכוסה בשכבה צפופה של אקסונים oligodendrocytes צריך להיות טעון על גבי שכבת axonal.
באיור 1. איורים סכמטי של תפוקה גבוהה פלטפורמת CNS תא רב microfluidic שיתוף תרבות נוירון. חתך להציג מראה ובידוד של אקסונים מ סומה ו דנדריטים עצביים כמו גם בידוד fluidic בין תאים עם הפרש דקה רמת fluidic. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.
2. איור ייצור צעדים הרכבה עבור תא רב PDMS microfluidic שיתוף תרבות המכשיר. כל התקן מתאים לאחד היטב צלחת קונבנציונאלי 6-גם תא פוליסטירן תרבות. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פיתחנו תא רב שיתוף תרבות פלטפורמה לחקר יונקים CNS-האקסון גליה אינטראקציה. אקסונים CNS בודדו בהצלחה מתא גופים העצבית / דנדריטים, ו oligodendrocytes היו בהצלחה שיתוף בתרבית בתוך המכשיר. צפיפות Neuron יכולים להיות מגוונים על ידי יישומים, אבל בריכוז נמוך מדי או גבוה מדי עלול לגרום לתאים למות. כמו כן, חשוב לשנות רק מחצית התקשורת בתרבות כך תאים או שכבת axonal על פני המצע אינם פגומים. אנו צופים כי המערכת הזו תהיה כלי רב עוצמה ללימוד CNS-האקסון גליה איתות רשתות במבחנה לספק נתיב לכיוון הפלטפורמה תפוקה גבוהה לצמיחה גורמים ההקרנה או לתרופות פוטנציאליות לקדם myelination ותיקון המיאלין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים / המכון הלאומי לבריאות הנפש (NIH / NIMH) מענק # 1R21MH085267.
References
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. 6, 683-690 (2005).
- Xia, Y., Whitesides, G.
- Taylor, A. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Methods. 2, 599-605 (2005).
- Li, J., Baud, O., Vartanian, T., Volpe, J. J., Rosenberg, P. A., A, P. Peroxynitrite generated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase mediates microglial toxicity to oligodendrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 9936-9941 (2005).
