マルチコンパートメントのCNSニューロングリア共培養マイクロ流体プラットフォーム

Summary

我々は、in vitroでのCNS軸索 - グリア相互作用の研究のための新規マルチコンパートメントの神経細胞の共培養マイクロシステムプラットフォームを開発。プラットフォームは、並行して6つの独立した実験まで行うことが可能であり、新たに開発したマクロ/マイクロハイブリッドの製造方法を用いて作製した。

Abstract

我々は、高スループットの並列で6つの独立した実験まで行うことができるin vitroでの中枢神経系における軸索-グリア相互作用の研究のための新しいマルチコンパートメントの神経細胞の共培養マイクロシステムプラットフォームを、提示する。我々は、再現性良く大量製造を可能にする、単一のソフトリソグラフィーのプロセスを介して同じデバイス内でミクロとマクロの両方のスケール構造を有するマイクロ流体デバイスを作成するための新しい製造法を開発した。

マルチコンパートメント流体共培養のプラットフォームは、オリゴデンドロサイト（OLS）のための神経細胞と6軸索/グリア細胞コンパートメント用のソーマのコンパートメントで構成されています。相馬コンパートメントと軸索/グリア細胞のコンパートメントは、軸索は軸索/グリアコンパートメントに成長できるようにしながら、物理的障壁として機能するが、相馬のコンパートメントの神経細胞体を閉じ込めることが軸索誘導マイクロの配列で接続されています。軸索/グリアコンパートメントにロードされたOLSは、ローカライズされた軸索 - グリア相互作用の研究を可能にする、軸索ではなく、神経細胞体や樹状突起とだけ対話することができます。マイクロチャネルはまた、6つの独立した実験は、より高いスループットのために単一のデバイス上で実施できるように、コンパートメント間の流体分離を有効にする。

ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）を用いたソフトリソグラフィは、生物医学マイクロデバイスで一般的に使用される技法です。これらのデバイス上の貯水池は、一般的にマニュアルパンチングにより定義されています。プロセスの簡単な、貧しい人々の配置と時間のかかる性質は、貯水池の大規模な数字が繰り返し作成する必要があるときに、このプロセスは適していないですが。新たに開発した方法は、このような限界を克服し、貯水池のマニュアルパンチングを必要としなかった。最初に、七貯水池（深さ：3.5 mm）の微粉砕機を用いて、ポリ（メチルメタクリレート）（PMMA）のブロックで行われた。その後、ガラス基板上に作製した尾根の微細構造の配列は、細胞体および軸索/グリア細胞コンパートメントを接続するマイクロチャネルを定義するためにPMMAブロックに対して、ホットエンボス加工された。このプロセスは、単一のPMMAマスター内で一致するようにマクロスケールのリザーバー（3.5 mm）およびマイクロスケールのチャネル（2.5μm）で生じた。金型マスターを務めたPDMSのレプリカは、ソフトリソグラフィーと最終的なPDMSデバイスはこのマスターからレプリケートされたを使用して得られた。

E16 - 18ラットの一次ニューロンは細胞体のコンパートメントにロードされ、二週間培養した。細胞培養の一週間後、軸索は、マイクロチャネルを交差させ、軸索/グリアれた区画内の軸索のみがネットワーク層を形成した。軸索P1 - 2匹のラットから六索/グリア細胞コンパートメントとOLS全体に均一に成長したが共存培養のためのin vitroで 14日間で軸索/グリア細胞区画に追加されました。

Protocol

パート1：マルチコンパートメントのニューロンの共培養装置の製造のためのマスターの金型を準備

1. PMMAマスターを製作する最初のステップは、3.5 mm深さの区画を作ることです。 One相馬コンパートメントと6軸索/グリア細胞の区画は、微粉砕機（MDX - 40、ローランドまたは他のCNC加工機）を使用して、PMMAのブロックで定義されています。 PMMAマスターは、破片を除去するために10分間イソプロピルアルコールで超音波処理しています。
2. 2.5μmの高い尾根の構造体の配列は、ガラスのウェットエッチングに続いて、標準的なフォトリソグラフィープロセスにより、50.8ミリメートルX 50.8ミリメートルのガラススライドを、上にパターニングされています。
   最初に、リッジ構造体の配列は、フォトリソグラフィを用いたポジ型フォトレジストS1818で洗浄したガラス基板上にパターニングされる。 S1818は、110℃に基づいて基板上にスピンコート（4000rpmの）、柔らかいです° 40用MF319でフォトレジストの開発に続いてマスクアライナを用いて5分間、そしてその後、紫外線に露出（84ミリジュール/ cm ^2）のためのC秒。次に、フォトレジストパターニングされたガラス基板は、2.5μmの背の高い尾根の構造を得るために6から7分間、室温でエッチバッファ酸化物（BOE）に浸漬する。最後に、フォトレジスト層は、脱イオン（DI）水で完全に洗い流すことが続いて、アセトンとイソプロピルアルコールで除去される。
3. マイクロリッジ構造を持つガラス基板は、そのパターンを転写するPMMAのマスターに対してホットエンボス加工です。
   最初に、PMMA金型マスターとガラス基板を手動で整列し、ホットプレスに配置されます。その後、温度を115℃に上げいったん所望の温度に達すると、重量の0.5トンを5分間適用されます。 5分後、温度を40℃、圧力が解放されるために冷却される。 PMMAのマスターは、50.8ミリメートルX 50.8ミリメートルの大きさのブロックに切断される。
4. 1重量：PDMSプレポリマー（Sylgard 184）10の比率で硬化​​剤と混合される。
5. PMMAマスターは、大樽の内側に配置されており、PDMSの混合物をPDMSのマスターを作製するPMMAのマスターの上に注がれている。その後、真空ポンプに接続してデシケーターに配置されます。 PDMSは、PDMS混合プロセス中に発生する気泡を除去するために15分間脱気されたPMMAマスターの上に注いだ。
6. すべての泡が削除されたときに、PDMSを重合するための1時間水平に85 ° Cのオーブン内に配置されています。
7. 一度PDMSが完全に硬化して、PDMSのマスターは、PMMAマスターから剥離し、トリクロロシランの2〜3滴とデシケーターの中に配置し、蒸気のコートに15分PDMSマスターの表面のためにバキュームされます。トリクロロシランコーティングは、PDMSのマスターから、最終的なPDMSニューロン共培養装置の放出を促進する。コーティング後は、PDMSのマスターは、簡単に過剰なトリクロロシランを除去するイソプロピルアルコールで洗浄し、N ₂ガ ​​スで乾燥させる。

パート2：ニューロンの培養装置の複製

1. 1重量：PDMSプレポリマー（Sylgard 184）10の比率で硬化​​剤と混合される。
2. PDMSの混合物は、PDMSマスターの上に注ぎ、15分間真空ポンプに接続してデシケーター内部の脱気する。それは、マスター上の3.5 mmの高PDMS構造が完全に浸漬されていないようにあまりにも多くのPDMSを注ぐようにすることが重要です。
3. すべての泡が削除されたときに、PDMSを重合するための1時間水平に85 ° Cのオーブン内に配置されています。
4. PDMSは一時間後にオーブンから取り出し、冷却するために室温で放置されています。その後、PDMSニューロン培養装置を穏やかにPDMSのマスターから剥離されています。 PDMSデバイス剥がれ粉塵や破片からそれらを保護するためにパラフィルムでラップされています。
5. パラフィルムでラップされたPDMSデバイスは、ブレードを装備したドリルプレスを使用して、個々の小片に切断されています。

パート3：デバイスの組立

1. PDMSニューロンの培養装置は、プラズマクリーナーの内部に配置し、PDMSデバイスの表面が親水性にするため90秒間空気プラズマに露出される。このプラズマ処理は、ポリ- D -リジンコートした基質の組立後に培地が充填されるマイクロチャネルを容易にするでしょう。
2. プラズマで処理機器は、滅菌のための30分間70％エタノールに浸漬し、滅菌バイオフードの内側に移動されます。
3. 滅菌装置は、70％エタノールから取り出し、ミリポアフィルタ処理されたN ₂ガ ​​スで乾燥されています。乾燥装置は、6ウェル培養プレートと穏やかな圧力は、基板とデバイス間のシール性を確保するために適用されるポリ- D -リジンコートしたポリスチレンの最上位に配置されます。
4. 文化メディアは、6個軸索/グリア細胞コンパートメントを充填し、次いで、細胞体のコンパートメントに充填される。それは泡がマイクロチャネル内にトラップされていないことを保証するために細胞体のコンパートメントに培地を追加した後に軸索/グリア細胞コンパートメントを充填する前に1〜2分の休止を与える方が良いです。
5. 培地で満たされたデバイスは、すべての可能なゴミや有毒な残留物を洗うために℃インキュベーターで一晩37の内部にインキュベートする。

パート4：セルの負荷とニューロン-オリゴデンドロサイト共培養

1. 細胞培養の最初の日に、日胚からの主な前脳のニューロンの細胞は16から18匹のラットを500細胞/ mm ²の記録密度で細胞体のコンパートメントにロードされます。最初に、細胞体のコンパートメントと軸索/グリア細胞区画の両方の内側培養培地は、前のセルの負荷にピペットを用いて吸引されています。その後、培地を40μlに希釈38500細胞は、マイクロチャネル入口付近相馬のコンパートメントにロードされます。それは、デバイスと基板間のシールを破ることができるので、細胞のロード中にPDMSデバイスに触れないようにすることが重要です。
2. 基質への細胞接着を強化するために37℃のインキュベータ内の30分間、細胞ロードされたデバイスをインキュベートする。インキュベーション後、すべてのコンパートメントは、培養培地で埋めています。
3. 細胞を37で培養されています°加湿5％CO ₂インキュベーター内でCと培地の半分だけが3〜4日ごとに出力が変更されています。
4. in vitroでのニューロンの文化の14日後に、オリゴデンドロサイトは、共存培養のための軸索/グリア細胞区画に追加されます。生後1-2にSprague - Dawleyラットの大脳半球から切開オリゴデンドロサイトは、1000細胞/ mm ²の面積密度で各軸索/グリア細胞コンパートメントに追加されます。前にロードする細胞に、区画内の培地の約60％をピペットで吸引されています。それは、基板上に形成された軸索のネットワークに損害を与えることができるので注意が、底部基板に触れないように行う必要があります。その後、培地を5μlに希釈した6700オリゴデンドロサイト細胞は、軸索/グリア細胞区画に追加されます。細胞は、1時間インキュベートされ、コンパートメントは、培地で埋めています。
5. 細胞を37℃で培養されています°培地のC加湿5％CO ₂インキュベーター内と半分だけが、さらに2週間ごとに3-4日を変更されます。

パート5：代表的な結果：

実験が正しく行われている場合、細胞体のコンパートメントにロードされたニューロンの細胞は、培養の1週間後に軸索/グリア細胞のコンパートメントの内部に形成するために開始に近いマイクロチャネル入口と軸索の層に探します。ソーマのコンパートメント内のニューロンの細胞凝集の兆候は、細胞が健全ではないことを示している可能性があります。ニューロンの文化の二週間後にオリゴデンドロサイトをロードするとき、軸索/グリア細胞コンパートメントは軸索とオリゴデンドロサイトの緻密層で覆われるべき軸索の層の上にロードする必要があります。

図1ハイスループットマイクロ流体のマルチコンパートメントのCNS ​​ニューロンの共培養のプラットフォームの模式図。神経細胞体と樹状突起と同​​様に微小流体レベルの差があるコンパートメントとの間の流体分離から軸索の分離を示す断面図。してくださいここをクリックして図1の拡大バージョンを参照すること。

図2作製とマルチコンパートメントのアセンブリ手順PDMSマイクロ流体共培養装置。各デバイスは、従来の6穴ポリスチレンの細胞培養プレートの1つのウェルに収まります。してくださいここをクリックして図2の拡大バージョンを参照すること。

Discussion

我々は、哺乳類の中枢神経軸索 - グリア相互作用を研究するためのマルチコンパートメントの共培養のプラットフォームを開発しました。中枢神経系の軸索が正常に神経細胞体/樹状突起から単離された、とオリゴデンドロサイトが正常にデバイス内部で共培養した。ニューロンの密度は、アプリケーションによって変えることができるが、低すぎたり高すぎる濃度は、細胞が死ぬことを引き起こす可能性があります。また、基板上に細胞や軸索の層が損傷されないように培地の半分だけを変更することが重要です。我々は、このシステムは、in vitroで CNS軸索グリアシグナル伝達ネットワークを研究するための強力なツールになると成長因子または髄鞘とミエリンの修復を促進する潜在的な薬剤候補をスクリーニングするためのハイスループットなプラットフォームに向けてパスを提供することを期待しています。